Rato Epidérmico Neural Stem Cell Crest (EPI-NCSC) Culturas

Summary

Aqui nós mostramos o nosso método para isolar do mouse epidérmicas células da crista neural haste (EPI-NCSC). Técnica envolve a micro-dissecando folículos bigode, isolando o bojo e placeing-lo em cultura de tecidos. EPI-NCSC começam a emigrar a partir de explantes saliência para o substrato dentro de 3-4 dias.

Abstract

EPI-NCSC são remanescentes da crista neural embrionária em um local adulto, o bojo dos folículos pilosos. Eles são células-tronco multipotentes que têm a propriedade fisiológica de gerar uma grande variedade de tipos de células diferenciadas, inclusive neurônios, células nervosas de apoio, células musculares lisas, osso / células de cartilagem e melanócitos. EPI-NCSC são facilmente acessíveis na pele aveludada e podem ser isoladas como uma população altamente puro de células-tronco. Este vídeo fornece um protocolo detalhado para a preparação do mouse EPI-NCSC culturas de folículos bigode. A almofada de bigode de um rato adulto é removido, e os folículos whisker dissecados. Os folículos são então cortadas longitudinalmente e, posteriormente, transversalmente acima e abaixo da região bojo. A protuberância é removida a cápsula de colágeno e colocados em uma placa de cultura. EPI-NCSC começam a emigrar de explantes bojo 3-4 dias depois.

Protocol

Dissecção do Bulge de Folículos Whisker Adulto rato

1. Usamos 10 semanas a 6 meses ratos velhos. Ratos mais jovens, muitas vezes produzir mais células. Euthanize rato e animal submerge inteiro em 1:01 mistura de betadine (solução de iodo) e peróxido de hidrogênio (disponível em farmácias) para cerca de 3 minutos.
   
2. Squirt do mouse todo, especialmente a região facial, com etanol 75%, e levar o mouse para microscópio de dissecção em capela de fluxo laminar.
3. Dissecar almofadas bigode, evitando cuidadosamente corte em bulbos capilares e piscina em HBSS.
4. Dissecar folículos bigode e piscina em HBSS à temperatura ambiente. Fazer isso, mantendo a pele junto ao folículo piloso com uma pinça, e depois corte em torno do folículo com a tesoura reta. Cortar profundamente para evitar ferir os bulbos de cabelo.
5. Levante folículo whisker fora do bloco de bigode e colocado em placa de novo com HBSS fresco.
6. Lave adiposo frouxo e tecido dérmico com esguichos de tampão, até que os folículos whisker estão limpos. Se necessário, corte coragem de folículo bigode e remover o tecido aderente por raspagem e flushes repetida de HBSS.
7. Pin follilce cabelo limpo para Sylgard revestido prato de vidro Petri utilizando agulhas de tungstênio afiadas, usando micropinças para se agarrar a parte da pele ao lado do folículo.
8. Whisker corte folículo longitudically com um MicroBlade. Evitar o corte muito fundo, pois isso irá prejudicar a protuberância. Remoção de sangue com jatos repetida de HBSS até ido. Aparecimento de sangue é uma boa indicação de que o corte foi profundo o suficiente. Se o corte longitudial não é suficientemente longo, pode ser alongado com microtesoura dobrados.
9. Faça um corte transversal acima do nível do seio cavernoso e, posteriormente, um segundo corte transversal ao nível do anel no interior do seio, perto da pele.
10. Você vai ver agora a protuberância dentro da cápsula.
11. Pegar um final de à cápsula de colágeno com a pinça e roll out do bojo com uma agulha de tungstênio dobrados. Você vai ver agora a cápsula vazia e isolada do bojo.
12. Piscina isolada protuberâncias em uma placa de cultura separados em HBSS à temperatura ambiente. Certifique-se de qualquer outro tecido está contaminando as protuberâncias pool.

Cultura de explantes bojo

1. 35 placas de revestimento milímetros cultura com colágeno colocando 50 mL de colágeno e 10 ml estéril NaCl 6% ao lado do outro. Misture bem com uma pipeta Pasteyr duplo dobrado e empurrar para a borda da placa de cultura. Incubar durante a noite em um dessecador limpo, mas não deixe secar. Antes do uso, lavar as placas com solução salina.
2. Pré-incubar colágeno revestido e lavadas placas de cultura por aproximadamente 3 horas com meio de cultura. Meio de cultura é composto por 85% de alfa-MEM modificado, 10% de soro fetal bovino e 5% dia 11 extrato de embrião de galinha.
3. Depois de re-incubação, remova o meio de cultura a partir de chapas e adicionar várias protuberâncias com o meio o menos possível. Remova o meio de cultura em excesso.
4. Incubar por 1 hora, mas não mais, na célula incubadora em uma atmosfera com oxigênio umidificado 10% e 5% CO _2.
5. Após 1 hora, gentilmente adicionar 1,5 ml de meio de cultura. Explantes bojo devem aderir ao substrato de colágeno. Substituir 50% do meio de cultura diária.
6. Dentro de 3-4 dias, as células altamente migratórias vai emigrar de explantes bojo. Nota sua morfologia estreladas, motilidade e ausência predominante de célula-contatos. Ao longo dos próximos dias, mais células vão emigrar, e emigrou células irão proliferar com rapidez.
7. Remover bojo 2-3 dias após o início da EPI-NCSC emigração com uma agulha de tungstênio afiadas. Se as protuberâncias ficam mais tempo, eles tendem a achatar e tornar impossível a obtenção de pura EPI-NCSC culturas.
8. Importante: Rare células com morfologia achatada, que se tornam, por vezes, aparente vários dias mais tarde do que EPI-NCSC, e quais são menos móveis NÃO são EPI-NCSC, mas putativo de células-tronco da epiderme / progenitores. Culturas consistindo destas células, ou culturas mistas contendo EPI-NCSC e putativo de células-tronco da epiderme / progenitores precisam ser descartados.
9. Dica: Não manter as células por muito tempo em meio explante primário, como eles tendem a diferenciar rapidamente em alta densidade celular, supostamente devido a autócrina / parácrina de sinalização do fator de crescimento.

Discussion

Em virtude da sua capacidade migratória, EPI-NCSC pode ser isolado como uma população altamente puro de células-tronco, que podem ser expandidos in vitro. Como restos embrionários em um local adulto, EPI-NCSC são candidatos potencialmente atraente para futuras terapias com células de substituição, engenharia biomédica e / ou medicina regenerativa. Nós testamos EPI-NCSC em um modelo do rato de lesão da medula espinhal, onde eles mostram características desejáveis. Através do perfil de expressão gênica por LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / geo, número de série GSE4680) mostramos que, como esperado, embrionárias células da crista neural e EPI-NCSC compartilham um padrão de expressão semelhante gene, que difere da de vizinhos epidérmica de células-tronco e outras células da pele residente tronco / progenitoras.