Topo Epidermal cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC) Culture

Summary

Qui mostriamo il nostro metodo per isolare il mouse epidermiche cresta neurale delle cellule staminali (EPI-NCSC). Tecnica prevede micro-dissezione follicoli baffi, isolando il rigonfiamento e placeing in colture di tessuti. EPI-NCSC iniziano a emigrare da espianti rigonfiamento sul substrato entro 3 - 4 giorni.

Abstract

EPI-NCSC sono i resti della cresta neurale embrionale in una posizione adulta, il rigonfiamento dei follicoli piliferi. Si tratta di cellule staminali multipotenti che hanno la proprietà fisiologiche di generare una vasta gamma di tipi di cellule differenziate, tra i neuroni, cellule nervose di supporto, le cellule muscolari lisce, osso / le cellule della cartilagine e melanociti. EPI-NCSC sono facilmente accessibili nella pelle pelosa e può essere isolato come una popolazione altamente pura di cellule staminali. Questo video fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione del mouse EPI-NCSC culture dai follicoli dei baffi. Il pad baffi di un topo adulto viene rimosso, e follicoli baffi sezionato. I follicoli vengono quindi tagliati longitudinalmente e poi trasversalmente sopra e sotto la regione di rigonfiamento. Il rigonfiamento viene rimosso dalla capsula collagene e posto in una piastra di coltura. EPI-NCSC cominciano a emigrare dal espianti rigonfiamento 3 o 4 giorni dopo.

Protocol

Dissezione del Bulge dai follicoli adulti Whisker mouse

1. Noi utilizzare 10 settimane a 6 mesi topi vecchi. Giovani topi spesso produrre più cellule. Euthanize mouse e animali sommergere tutto in miscela 1:1 di betadine (soluzione di iodio) e perossido di idrogeno (disponibile da farmacia) per circa 3 minuti.
   
2. Bagnate topo intero, in particolare la regione del viso, con il 75% di etanolo, e portare il mouse microscopio a dissezione in cappa a flusso laminare.
3. Sezionare portabaffi, evitando accuratamente di taglio in bulbi dei capelli e piscina in HBSS.
4. Sezionare i follicoli baffi e piscina in HBSS a temperatura ambiente. Farlo tenendo la pelle accanto al follicolo pilifero con una pinza, e poi il taglio di tutto il follicolo con le forbici diritte. Tagliato profondamente per evitare di ferire bulbi piliferi.
5. Sollevare follicolo soffio fuori pad baffi e mettere in nuova piastra con HBSS fresca.
6. Flush adipous sciolti e tessuto cutaneo con schizzi di buffer, fino a quando i follicoli baffi sono pulite. Se necessario, tagliare coraggio di follicolo baffi e rimuovere il tessuto aderente raschiando e vampate di ripetute HBSS.
7. Pin follilce pulire i capelli sul piatto di vetro rivestite Sylgard Petri con aghi affilati tungsteno, utilizzando microforceps per tenere sulla parte della pelle accanto al follicolo.
8. Baffi tagliati follicolo longitudically con un MicroBlade. Evitare di tagliare troppo profondamente, in modo da ferire il rigonfiamento. Rimuovere il sangue con schizzi ripetuti fino HBSS andato. Aspetto di sangue è una buona indicazione che il taglio era abbastanza profonda. Se il taglio longitudial non è sufficientemente lunga, può essere allungato con microscissors piegato.
9. Fare un taglio trasversale sopra il livello del seno cavernoso e successivamente un secondo taglio trasversale a livello all'interno del seno anello, vicino alla pelle.
10. Vedrete ora il rigonfiamento all'interno della capsula.
11. Afferra la fine di capsula di collagene con le pinze e stendere il rigonfiamento con un ago di tungsteno piegato. Vedrete ora la capsula vuota e il rigonfiamento isolato.
12. Piscina isolato rigonfiamenti in una piastra di coltura separata HBSS a temperatura ambiente. Assicurarsi che nessun altro tessuto sta contaminando i rigonfiamenti pool.

Cultura della Espianti rigonfiamento

1. Cappotto 35 piatti millimetri cultura con il collagene mettendo 50 microlitri di collagene e 10 microlitri sterile di NaCl al 6% l'uno accanto all'altro. Mescolare bene con un doppio piegato pipetta Pasteyr e spingere verso il bordo della piastra di coltura. Incubare per una notte in un essiccatore pulito, ma non lasciate asciugare. Prima dell'uso, lavare i piatti con soluzione salina.
2. Pre-incubazione piastre di coltura collagene rivestito e risciacquati per circa 3 ore con il terreno di coltura. Terreno di coltura è costituito da 85% alfa-MEM modificato, il 10% di siero fetale bovino e il 5% giorno 11 estratto di embrione di pollo.
3. Dopo aver ri-incubazione, togliere terreno di coltura da piatti e aggiungere con rigonfiamenti vari media il meno possibile. Rimuovere l'eccesso di media cultura.
4. Incubare per 1 ora, ma non di più, nella cella incubatore in atmosfera umidificata con 10% di ossigeno e 5% di CO _2.
5. Dopo 1 ora, delicatamente aggiungere 1,5 ml di terreno di coltura. Espianti rigonfiamento dovrebbero aderire al substrato di collagene. Sostituire il 50% del terreno di coltura quotidiano.
6. Entro 3 - 4 giorni, le cellule altamente migratorie emigreranno dal espianti rigonfiamento. Nota la loro morfologia stellate, la motilità, e l'assenza predominante del cellula-cellula contatti. Nel corso dei prossimi giorni, più celle emigreranno, ed emigrò cellule si moltiplicano rapidamente.
7. Rimuovere rigonfiamento 2 - 3 giorni dopo l'inizio dei EPI-NCSC emigrazione con un ago di tungsteno affilata. Se i rigonfiamenti sono rimasti più a lungo, tendono ad appiattire e rendere l'impossibilità di ottenere puro EPI-NCSC culture.
8. Importante: le cellule rare con morfologia appiattita, che diventano a volte evidenti alcuni giorni più tardi EPI-NCSC, e che sono meno mobili NON sono EPI-NCSC, ma putativo cellule staminali epidermiche / progenitori. Culture composto di queste cellule, o colture miste contenenti EPI-NCSC e putativo cellule staminali epidermiche / progenitori devono essere scartati.
9. Suggerimento: NON mantenere le cellule troppo a lungo in media espianto primario, in quanto tendono a differenziare rapidamente ad alta densità cellulare, presuntamente a causa di autocrino / paracrino di segnalazione del fattore di crescita.

Discussion

In virtù della loro capacità migratorie, l'EPI-NCSC può essere isolata come una popolazione altamente pura di cellule staminali, che possono essere espanse in vitro. Come resti embrionale in una posizione adulta, l'EPI-NCSC sono candidati potenzialmente interessanti per future terapie di sostituzione cellulare, ingegneria biomedica e / o medicina rigenerativa. Abbiamo testato EPI-NCSC in un modello murino di lesioni del midollo spinale, dove si mostrano i tratti desiderabili. Attraverso profili di espressione genica LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / geo, serie numero GSE4680) abbiamo dimostrato che, come previsto, embrionale cellule della cresta neurale e EPI-NCSC condividere un simile pattern di espressione genica che differisce da quella della vicina le cellule staminali epidermiche e altre pelle cellule staminali residenti / progenitori.