Summary
여기 마우스 표피 신경 능선의 줄기 세포를 (에피 NCSC) 분리하기 위해 방법을 보여줍니다. 기술과 관련된 마이크로 해부, 수염 모공 볼록한 분리하고 조직 문화에 그것을 placeing. 사일 - 에피 NCSC 3 이내 하층에 팽창의 explants에서 이민을 시작합니다.
Abstract
에피 NCSC는 성인 위치, 모낭의 팽창에 배아 신경 문장의 잔해입니다. 그들은 뉴런, 신경 세포 지원, 평활근 세포, 뼈 / 연골 세포와 melanocytes를 포함한 차별화된 세포 유형의 다양한 배열을 생성하는 생리 특성을 보유 multipotent 줄기 세포입니다. 에피 NCSC는 털이 피부에 쉽게 접근할 수 있으며 줄기 세포의 높은 순수 인구로 격리 수 있습니다. 이 동영상은 수염의 모공에서 마우스 에피 NCSC의 문화를 준비 상세한 프로토콜을 제공합니다. 성인 마우스의 수염 패드는 제거하고, 수염 머리카락이 해부하는 것입니다. 모공은 다음 팽창 지역 위 아래 길이 방향과 이후 transversely 절단됩니다. 팽창은 콜라겐 캡슐에서 제거하고 문화 접시에 배치됩니다. 에피 NCSC 3 ~ 4 일후 팽창의 explants에서 이민을 시작합니다.
Protocol
성인 마우스 위스커의 모공에서 벌지의 해부
- 우리는 10 주 6 개월 생쥐를 사용합니다. 젊은 생쥐는 종종 더 많은 세포를 얻을 수 있습니다. betadine (요오드 용액)와 약 3 분 과산화수소 (약국에서 구할 수)의 1시 1분 혼합으로 마우스와 잠수함 전체 동물을 안락사.
- 물총 전체 마우스, 특히 얼굴의 75 % 에탄올과 지역, 그리고 층류 흐름 후드의 해부 현미경으로 마우스를 수행합니다.
- 조심스럽게 머리 전구로 절단하고, HBSS에 수영장을 피하기 위해, 수염 패드를 해부하다.
- 상온에서 HBSS에 수염 머리카락과 수영장을 해부하다. 포셉로 머리 뿌리 옆에있는 피부를 개최하고, 다음 바로 가위로 뿌리 주위를 절단하여이 작업을 수행합니다. 머리 전구를 손상하지 않도록 깊이 잘라.
- 수염 패드의 수염 뿌리를 허용하고 신선한 HBSS와 새 접시에 넣어.
- 수염의 모공이 청소까지, 버퍼의 squirts을 느슨하게 adipous과 피부 조직을 플러시. 필요한 경우, 수염 뿌리에 신경을 절단하고 힘든하고 HBSS의 반복 플러시하여 자기편 조직을 제거합니다.
- 뿌리 옆에있는 피부 부분에 집중을위한 microforceps를 사용하여 날카롭게 텅스텐 바늘을 사용하여 Sylgard - 코팅 유리 페트리 접시에 깨끗한 머리 follilce 핀.
- 컷 수염은 microblade와 longitudically 대과. 이것은 팽창을 다치게하므로, 너무 깊은 절단하지 마십시오. 사라 때까지 HBSS의 반복 squirts와 혈흔을 제거합니다. 혈액의 외관자를 충분히 깊이 것을 좋은 표시이다. longitudial 상처가 충분히 오래되지 않은 경우, 그것은 벤트 microscissors로 길어 수 있습니다.
- 동굴 부비동의 수준 이상의 가로 잘라 고리 부비동 내에 수준에서 후 두 번째 가로 절단을 만들고, 피부에 닫습니다.
- 이제 캡슐 내부의 팽창을 볼 수 있습니다.
- 포셉과 콜라겐 캡슐에의 끝을 잡고 구부러진 텅스텐 바늘로 팽창을 롤. 이제 빈 캡슐과 격리 팽창을 볼 수 있습니다.
- 수영장 실온에서 HBSS에 별도의 문화 접시에 bulges을 분리. 다른 조직은 풀링된 bulges을 훼손하지 있는지 확인하십시오.
팽창의 Explants의 문화
- 50 μl 콜라겐과 서로 다음 10 μl 살균 6퍼센트 NaCl을 배치 코트 콜라겐과 35mm 문화 번호판. 이중 벤트 Pasteyr의 pipet과 잘 혼합하고 문화 판의 가장자리쪽으로 밀어. 깨끗한 dessicator에 야간 부화하지만, 건조하게하지 않습니다. 사용하기 전에 생리와 접시를 씻어.
- 문화 매체로 약 3 시간에 대한 사전 품어 콜라겐 - 코팅 및 씻어서 문화 번호판입니다. 문화 매체 85% 알파 - 수정 멤 10 % 태아 소 혈청 및 5 % 일 11 여자의 배아 추출물로 구성되어 있습니다.
- 다시 부화 후 접시에서 배지를 제거하고 가능한 한 작은 중소 여러 bulges를 추가합니다. 초과 문화 매체를 제거합니다.
- 10 %의 산소와 5% CO 2 humidified 분위기에서 세포 배양기에 1 시간을 위해 품어,하지만 더 이상.
- 1 시간 후, 부드럽게 문화 매체의 1.5 ML를 추가합니다. 벌지의 explants는 콜라겐 하층을 준수해야합니다. 일일 문화 매체의 50 %를 교체하십시오.
- 3 이내 - 4 일, 높은 철새 세포는 팽창의 explants에서 이주 것입니다. 그들의 별 모양의 형태, 운동성, 그리고 세포 세포 접촉의 주된 부재를 적어 둡니다. 앞으로 몇 일 동안, 더 많은 세포가 이주하고, 세포가 빠르게 세포 분열 따위에 의해 번식합니다 이민 것입니다.
- 날카롭게 텅스텐 바늘로 에피 NCSC의 이주의 발병 후 3 일 - 팽창 2 제거합니다. bulges가 더 이상 남아있다면, 그들은 평평하고 불가능한 순수 에피 NCSC 문화를 얻을 수 있도록하는 경향이있다.
- 중요 : 에피 NCSC보다 몇 일 후에 가끔은 겉보기되며, 평평 형태와 희귀 전지 에피 NCSC되지 않습니다 덜 운동성이있는 있지만, putative 표피 줄기 세포 / progenitors. 에피 NCSC와 putative 표피 줄기 세포 / progenitors를 포함하는 이러한 세포로 구성된 문화, 또는 혼합 문화는 폐기해야합니다.
- 힌트 : 그들이 putatively paracrine / autocrine 성장 인자의 신호로 인해, 높은 세포 밀도에서 급속하게 차별하는 경향으로, 기본 explant 매체에서 너무 오랫동안 전지를 보관하지 마십시오.
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Discussion
자신의 철새 능력을 가진, 에피 NCSC는 체외에서 확장 가능한 줄기 세포의 높은 순수 인구로 격리 수 있습니다. 성인 위치에서 배아 잔존물로서, 에피 NCSC는 향후 세포 대체 요법, 생명 의학 공학 및 / 또는 재생 의료에 대한 잠재적으로 매력적인 후보입니다. 그들이 바람직한 특성을 보여 우리는 척수 손상의 마우스 모델에서 에피 NCSC을 테스트했습니다. LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / 지리적, 시리즈 번호 GSE4680)에 의해 유전자 발현 프로 파일링을 통해 우리는 보여주었다, 예상대로, 배아 신경 크레스트 세포 에피 NCSC 공유 인근의에서 다른 유사한 유전자 발현 패턴을 표피 줄기 세포와 다른 피부 주민 줄기 세포 / progenitors.
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Acknowledgments
; 사우스 이스턴 위스콘신의 바이오 메디컬 기술 제휴, Milwauke, WI, 미국, 브라이언 Riesch 마비 재단, 밀워키, WI, 미국, 이글스의 성 주문, 중서부 장 USPHS 부여 NS38500, 신경계 장애의 국립 연구소와 stroke, NIH, 미국 : 지원 미국, 국립 척수 부상 협회, 밀워키 장, 미국, 노스 이스트 잉글랜드 줄기 세포 연구소, 뉴캐슬 대학, 영국.
References
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