Fare Epidermal Sinir Crest Kök Hücre (EPI-NCSC) Kültürler

Summary

Burada fare epidermal nöral krest kök hücreleri (EPI-NCSC) izole etmek için yöntem gösteriyor. Tekniği içerir mikro diseksiyon, bıyık kıl follikülleri, şişlik izole ve doku kültürü içine placeing. 4 gün - 3 gün içinde EPI-NCSC alt tabaka üzerine çıkıntı eksplantlar göç etmeye başlar.

Abstract

EPI-NCSC yetişkin bir konuma, saç köklerinin şişkinliği embriyonik nöral krest kalıntıları vardır. Onlar multipotent kök hücreleri nöronların, sinir destekleyen hücreler, düz kas hücreleri, kemik / kıkırdak hücreleri ve melanositler de dahil olmak üzere geniş bir yelpazede, farklılaşmış hücre türleri oluşturmak için fizyolojik özelliği vardır. EPI-NCSC saçlı deride kolaylıkla erişilebilir ve kök hücreler, son derece saf bir nüfus olarak izole edilebilir. Bu video bıyık kıl follikülleri fare EPI-NCSC kültürlerin hazırlanması için ayrıntılı bir protokol sağlar. Yetişkin bir farenin bıyık ped kaldırılır ve bıyık kıl follikülleri diseke. Folikülleri sonra şişkinliği bölgenin altında ve üstünde boydan boya ve daha sonra enine kesilir. Çıkıntı kollajen kapsül kaldırılır ve bir kültür plaka yerleştirilir. Epi-NCSC şişkinliği eksplantlar 3 ila 4 gün sonra göç etmeye başlar.

Protocol

Yetişkin Fare Whisker foliküllerin Bulge diseksiyonu

1. Biz 10 hafta ile 6 ay eski fareler kullanın. Genç farelerin, genellikle daha fazla hücre verim. Fare ve betadin (iyot çözeltisi) ve yaklaşık 3 dakika boyunca hidrojen peroksit (eczane) 1:1 karışımın içine daldırın tüm hayvan Euthanize.
   
2. Squirt tüm fare,% 75 etanol ile özellikle yüz bölgesi, ve laminer akış kaput diseksiyon mikroskobu fare taşımak.
3. Saç soğanı içine kesme, HBSS havuz ve dikkatle kaçınarak, bıyık pedleri parçalara ayır.
4. Oda sıcaklığında HBSS bıyık kıl follikülleri ve havuz teşrih. Bir forseps ile saç folikülü cilt tutan ve daha sonra düz makas ile folikül etrafında kesme bunu. Saç soğanı yaralamaktan kaçınmak için derin kesin.
5. Bıyık yastık bıyık folikül kaldırın ve taze HBSS ile yeni bir levha koymak.
6. Bıyık folikülleri temiz olana kadar tampon squirts gevşek adipous ve dermal doku yıkayın. Gerekirse, bıyık folikül sinir kesme ve kazıma ve HBSS tekrarlanan basması yapışık doku kaldırmak.
7. Deri parçası üzerine folikül yanında tutmak için microforceps kullanarak, bilenmiş tungsten iğneler kullanarak Sylgard kaplı cam Petri kabı üzerine temiz saç follilce Pin.
8. Kes bıyık MicroBlade longitudically folikül. Bu çıkıntı zarar gibi, çok derin bir kesme kaçının. Gitmiş kadar HBSS tekrarlanan squirts kan çıkarın. Kan Görünüm kesim yeterince derin olduğu için iyi bir göstergedir. Longitudial kesim yeterince uzun değilse, bükülmüş microscissors uzatılabilir.
9. Kavernöz sinüs seviyesinden enine kesilmiş ve daha sonra ikinci bir halka sinüs içinde düzeyinde enine kesilmiş, cilde yakın.
10. Artık kapsül içindeki çıkıntı göreceksiniz.
11. Forseps ile kollajen kapsül sona tut ve şişkinliği bükük bir tungsten iğne ile dışarı rulo. Artık boş kapsül ve izole bir çıkıntı göreceksiniz.
12. Havuzu, oda sıcaklığında HBSS bir ayrı bir kültür plakasına şişkinlikler izole edilmiştir. Başka hiçbir doku toplanmış şişkinlikler kirlenmesine neden olduğundan emin olun.

Çıkıntı eksplantlar Kültür

1. 50 ul kolajen ve birbirlerine önümüzdeki 10 ul steril% 6 NaCl koyarak Coat kollajen ile 35 mm kültür plakaları. Bir çift bükülmüş Pasteyr pipetlemeyin ile iyice karıştırınız ve kültür plaka kenarına doğru itin. Temiz bir desikatöre gece inkübe, ancak kuru izin vermeyin. Kullanmadan önce, tabak tuzlu su ile durulayın.
2. Kültür ortamı ile yaklaşık 3 saat önceden inkübe kollajen kaplı ve durulanır kültür plakaları. Kültür orta,% 85,% 10 fetal sığır serumu ve% 5 gün 11 civciv embriyo ekstresi Alpha-modifiye MEM oluşur.
3. Re-inkübasyondan sonra, tabak kültür ortamı kaldırmak ve mümkün olduğunca az orta birkaç şişkinlikler ekleyin. Aşırı kültür ortamı çıkarın.
4. Hücre kuvöz, 1 saat% 10 oksijen ve% 5 CO ₂ ile nemlendirilmiş bir atmosferde inkübe edin, ama uzun.
5. 1 saat sonra 1,5 ml kültür ortamı yavaşça ekleyin. Bulge eksplantlar kollajen altyapısını uymalıdır. % 50 günlük kültür ortamı değiştirin.
6. Içinde 3 - 4 gün, yüksek göç hücrelerinin şişkinliği eksplantlar göç edecektir. Stellat morfoloji, motilite ve hücre-hücre kişilerin hakim olmaması dikkat edin. Önümüzdeki birkaç gün içinde, daha fazla hücre göç ve hücreler hızla çoğalacak göç etti.
7. EPI-NCSC göç başlangıcı, ucu sivriltilmiş bir tungsten iğne ile şişkinliği 2 - 3 gün sonra çıkarın. Şişkinlikler daha uzun süre kalır, onlar düzleştirmek ve EPI-NCSC saf kültürleri elde etmek imkansız hale eğilimindedir.
8. Önemli: Nadir hücreler bazen birkaç gün sonra EPI-NCSC daha belirgin hale gelir ve basık morfolojisi, EPI-NCSC daha az hareketli, ancak varsayılan epidermal kök hücre / atalarıdır. EPI-NCSC ve varsayılan epidermal kök hücre / atalarıdır içeren bu hücrelerin oluşan Kültürler, ya da karma kültürlerin atılır gerekir.
9. İpucu: varsayılan parakrin / otokrin büyüme faktörü sinyalizasyon nedeniyle, yüksek hücre yoğunluğu hızla ayırt etmek eğilimi olarak hücreler, primer eksplant orta çok uzun süre tutmak.

Discussion

Onların göç yeteneği sayesinde, EPI-NCSC, kök hücreler, in vitro açılabilir son derece saf bir nüfus olarak izole edilebilir. Yetişkin bir yerde embriyonik kalıntıları olarak, EPI-NCSC gelecek hücre replasman tedavileri, biyomedikal mühendislik ve / veya rejeneratif tıp için çekici potansiyel adaylardır. Arzu özellikleri göstermektedir Biz, spinal kord yaralanması bir fare modelinde EPI-NCSC test ettik. LongSAGE (www.ncbi.nlm.nih.gov / coğrafi, seri numarası GSE4680) gen ekspresyon profili sayesinde gösterdi ki, beklendiği gibi, embriyonik nöral krest hücreleri ve EPI-NCSC payı komşu farklıdır benzer bir gen ekspresyonu desen epidermal kök hücre ve diğer cilt ikamet kök hücre / atalarıdır.