Summary
العرض مستضد في الأجهزة اللمفاوية الثانوية من قبل خلايا الجذعية هو أمر حاسم لبدء بوساطة الخلايا التائية الاستجابة المناعية التكيفية. نحن هنا لشرح ثقافة نخاع العظم الخلايا الجذعية المستمدة الفئران ، التنشيط ، ووضع العلامات لمدة 2 الفوتون التصوير.
Abstract
يمكن العثور على العديد من الطرق لتحضير الخلايا الجذعية في الفئران الأدب. هنا ، نقدم طريقة التي تنتج CD11c عالية أكبر من 85 ٪ في الخلايا الجذعية الثقافة التي يعيش في العقدة الليمفاوية تجفيف بعد الحقن تحت الجلد وهذا المستضد للخلايا T مستضد معين (انظر الفيديو). بالإضافة إلى ذلك ، ونحن نستخدم الآلات ايسن Incucyte لتعقب الخلايا الجذعية النضج ، حيث ، في يوم 10 ، مورفولوجيا الخلايا المستزرعة هي الحال في خلية الجذعية الناضجة و<85 ٪ من الخلايا CD11chigh. كشفت دراسة العرض مستضد في الغدد الليمفاوية الطرفية بنسبة 2 الفوتون التصوير أن هناك ثلاث مراحل متميزة من الخلايا الجذعية والتفاعل خلية T 1 و 2. المرحلة الأولى تتكون من الاتصالات بين الخلايا وجيزة المسلسل مستضد تي متحركة محددة للغاية ويحمل مستضد الخلايا الجذعية 1 و 2. تتميز المرحلة الثانية من خلال اتصالات طويلة بين المستضد محددة الخلايا التائية والخلايا الجذعية تحمل المستضد 1 و 2. أخيرا ، تتميز المرحلة الثالثة من قبل خلايا تي من فصل الخلايا الجذعية ، واستعادة القدرة على الحركة وبداية لتقسيم 1 و 2. هذا مثال واحد من هذا النوع من التفاعلات محددة مستضد التي يمكن تحليلها من قبل اثنين من الفوتون التصوير من مستضد محملة الخلايا خلية الصبغة التي تحمل علامات تعقب شجيري.
Protocol
1) إزالة عظام الفخذ كلا من الماوس
- استخدام مقص لقطع تشريح العضلات والعظام عظم الفخذ تعرض فوق وتحت المفاصل (الركبة والورك). فهم وسط عظم الفخذ مع ملاقط التشريح وقطع فوق وتحت مفاصل لمغادرة قدر من الكردوس سليمة قدر الإمكان.
- كما العضلات قبالة نظيفة قدر الإمكان باستخدام مقص تشريح الصغيرة. نقل عظم الفخذ في طبق من RPMI.
- وينبغي تنفيذ كل الإجراءات في غطاء محرك السيارة من هذه النقطة ، وذلك باستخدام وسائل الاعلام فقط العقيمة ، والصكوك ، نصائح ماصة والأطباق الثقافة.
2) عقم العظام عظم الفخذ :
- في غطاء محرك السيارة ، ونقل العظام من RPMI إلى صحن الثقافة صغيرة مليئة الايثانول 70 ٪ على الجليد.
- السماح لامتصاص العظام في الإيثانول لمدة 5 دقائق على الجليد.
3) جمع نخاع العظم تحت ظروف معقمة :
- نقل العظام إلى صحن صغير يحتوي على ثقافة العقيمة التي تمت تصفيتها ثقافة العاصمة الابتدائية وسائل الإعلام.
- مع ملاقط معقمة ، عقد العظام أكثر من طبق تجاهل أو أنبوب ، والعقيمة مع مقص ، وقطع كل epiphesis (نهايات العظام) قبالة. وينبغي خفض فضح نخاع العظم الذي هو مشرق الحمراء في وسط العظام.
- مع حقنة معقمة (26-28 إبرة قياس) ، تمتص حوالي 100-200 مل من وسائل الاعلام العقيمة.
- عقد العظام مع ملاقط معقمة على طبق جديد من وسائل الإعلام معقمة وادخال الإبرة في جانب واحد من العظام. موقف رأس الإبرة بالقرب من الجزء العلوي من عظم وغسل العظام ببطء خارجا مع وسائل الإعلام العقيمة. إذا كنت في وسط العظم ، ينبغي أن الإبرة في الشريحة بسهولة.
- نخاع العظم يغسل بها ، سواء في قطع صغيرة أو قطعة واحدة. وينبغي أن يتم مسح بها من العظام والى صحن من وسائل الإعلام العقيمة.
- كرر هذه الخطوة حسب الحاجة لغسل تماما في نخاع العظم خارج.
- عندما العظام نظيفة ، سيكون أبيض وشفافة.
- كرر هذا الإجراء مع عظم الفخذ الأخرى. تجاهل كل عظم الفخذ مرة واحدة كانت نظيفة.
4) إعادة تعليق وتدور باستمرار خلايا نخاع العظم :
- نقل الخلايا إلى أنبوب الصقر العقيمة.
- إذا نقي لا تزال سليمة ، بلطف جدا ماصة وسائل الاعلام صعودا وهبوطا في الطبق ، لتفريق نخاع الى تعليق خلية واحدة. قد يستغرق ذلك عدة دقائق ، وينبغي أن يتم ببطء لتجنب قتل الخلايا عن طريق القوة المحضة.
- خلايا الطرد المركزي كما تفعل أي خلايا أخرى الثدييات.
5) انحلال الخلايا :
- إزالة أنبوب من أجهزة الطرد المركزي بعد الانتهاء من زيادة ونقصان وسائل الإعلام من أجل إيقاف (صب) في النفايات صغيرة (50 مل أنبوب الصقر) في غطاء محرك السيارة.
- Resuspend بيليه بواسطة عبها بلطف الجزء السفلي من الأنبوب.
- المعقمة باستخدام الماء المصفى وDPBS 10X 10X أو برنامج تلفزيوني ، بإجراء تحلل الماء لإزالة خلايا الدم الحمراء (كرات الدم الحمراء) باستخدام وحدات التخزين التالية :
- 900 مليلتر من الماء المعقم تصفيتها
- 100 مل أو DPBS 10X 10X PBS
- إضافة 100 مل من ثانية PBS 10X 50-10 بعد إضافة الماء. من المهم جدا القيام بذلك فورا حتى يتم lysed فقط كرات الدم الحمراء. انها فكرة جيدة ان يكون كل من ماصات المعبأة والجاهزة.
- إضافة 5 مل -- 10 مل من العقيمة وسائل الإعلام الأساسية العاصمة.
6) عدد الخلايا :
- في هود ، وخلط مل 6 إلى 11 من خلايا نخاع العظام التي تدور بلطف أنبوب مع انعكاس طفيف ، والميل 45 درجة (وليس وسائل الإعلام بحيث يلامس الجزء العلوي من الأنبوب)
- إزالة 10 مل من وسائل الإعلام في أنبوب عقيمة لفرز الأصوات.
- إعادة رسملة الخلايا وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى.
7) الخلايا شجيري التصفيحات :
- وينبغي مطلي الخلايا في كثافة 106/mL × 1.
- إزالة الخلايا من أجهزة الطرد المركزي ، ووسائل الإعلام والخلايا صب اعادة تعليق في كمية مناسبة من وسائل الإعلام العاصمة الابتدائية للتصفيح.
- مكان في أنسجة الثقافة الحاضنة.
8) رعاية الثقافة والنضج :
دائما التحقق من الثقافات قبل إضافة المزيد من وسائل الإعلام أو في أي استخدام التجارب. فحص الصحة العامة للخلايا والبحث عن تلوث محتمل.
اليوم 0 : الخلايا الجذعية مطلي.
اليوم 3 : إزالة 75 ٪ من وسائل الإعلام والخلايا غير adherant الابتدائية وإضافة وسائل الإعلام مرة أخرى العاصمة.
اليوم 6 : بعد التصفيحات الخلية الأولي : إعادة لوحة الخلايا باستخدام الإجراء التالي :
- إزالة وسائل الإعلام ، التي ينبغي أن تحتوي على بعض البلدان النامية غير adherant عند هذه النقطة ، ومكان معقم في 50 مل أنبوب الصقر ، وترك لوحات جدا رطبة قليلا (كنت لا تريد الخلايا الملتصقة لتجف)
- إضافة 3 مم EDTA في برنامج تلفزيوني على كل صفيحة ، والسماح للجلوس لمدة 5 دقائق.
- عقد لوحة بزاوية 45 درجة وسائل الإعلام ماصة بلطف صعودا ونزولا على الجزء السفلي من لوحة لطرد بلطف غير adherant الخلايا.
- ينبغي EDTA / PBS تصبح أكثر سمكا يجري جمع الخلايا تشير من أسفللوحة.
- بعد عدة دقائق من ذلك ، يمكن نقل خليط الخلية في أنبوب 50 مل الصقر.
- تدور كل الخلايا بعد تنفيذ هذا الإجراء لكل لوحة.
- لوحة العد والخلايا في مناطق ذات كثافة من 1 × 10 ^ 6 في المائة في وسائل الإعلام لوحة الثانوية في العاصمة الجديدة العقيمة أطباق ثقافة 10 سم. عودة إلى خلايا الأنسجة الثقافة الحاضنة.
اليوم 11/10
البلدان النامية ناضجة جاهزة للتحفيز / مستضد التحميل.
9) شجيرى تحفيز الخلية :
- استخدام LPS (lipopolyscaccharide) في تركيبة مع الببتيد المطلوب للتنشيط وتحميل الببتيد. اعتمادا على مصدر من LPS ، قد تختلف الظروف التحفيز إعطاء أفضل النتائج. بالإضافة إلى ذلك ، ينبغي أن يكون الأمثل للمبلغ المطلوب من الببتيد لعرضها العاصمة. كانت الظروف في تحفيز هذا البروتوكول 100 نانوغرام / مل و 100 LPS ميكروغرام / مل OVA (ovalbumin).
- مستضد تحميل / لعلاج مع LPS 18-24 ساعة قبل الحصاد / الاستخدام.
وقد أضيف بعد كل مرشح العقيمة : وسائل الإعلام خلية شجيري
الرجاء مراجعة قسم مناقشة لاستعراض مختلف الظروف شجيري خلية ثقافة والنمط الظاهري للخلية الجذعية الناتجة عن ذلك. وقد صممت هذه الظروف لإنتاج ثقافة الخلايا الجذعية الناضجة التي يقطنها بسرعة تجفيف الغدد الليمفاوية ، 18-24 ساعة بعد الحقن تحت الجلد والمستضد الحالي بكفاءة.
وقد أضيف عامل تصفية العقيمة بعد كل شيء : وسائل الإعلام الرئيسية DC
- 500 مل IMDM (إزالة 55-60 مل الحجم النهائي لل500mL)
- 50 مل FBS الحرارة المعطل
- 5 مل من 200 ملي L - GLN ، وتركيز النهائي من 2 مم
- 100 وحدة دولية / مل من البنسلين و 100 ملغ / مل الستربتوميسين (5 مل من القلم وحدة دولية / مل 10000 و 10،000 سهم بكتيريا ملغ / مل)
- 50 B - UM البيانات (14.3 B - M البيانات الأوراق المالية ، وتمييع 1:100 في هود الكيميائية ، واستخدام المجاهدين 35 لكل 100 مل من وسائل الإعلام للتركيز micromolar 50)
- 20-30 نانوغرام / مل GM - CSF
- 100-400 وحدة دولية / مل IL - 4 10 تقريبا -- 40 نانوغرام / مل
* وسائل الإعلام لSecondaryDC نضوج
100 نانوغرام / مل TNF - ألفا (إضافة إلى وسائل الإعلام العاصمة الابتدائي)
* ملاحظة : GM - CSF + IL - 4 ينبغي أن تنتج الخلايا الجذعية غير الناضجة. وسوف تستخدم جنرال موتورز + IL4 - CSF (400 وحدة دولية / UL) + TNF - ألفا (100 ميكروغرام / مل) إنشاء خلايا تشبه الخلايا الجذعية الناضجة الوحيدات مشتقة. ومن المعروف عن الخلايا الجذعية الناضجة لا يستغرق مستضد كما بكفاءة والخلايا الجذعية غير الناضجة والثقافات المحلية قد نشرت TNF - A من خلايا انسجة 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
الخلايا الجذعية هي الوسطاء الرئيسيين للاستجابة المناعية التكيفية والخلية مستضد الأكثر كفاءة تقديم تتسم حتى الآن. طرق الإنسان والثقافة الماوس الخلية الجذعية في الأدب تختلف في نوع من السيتوكينات استخدامها للتأثير على تطوير أنواع مختلفة من الخلايا الجذعية. خصوصا ، وتستخدم GM - CSF ، flt3L ، IL4 ، IL13 ، TNF ألفا والإنترفيرون جاما في تركيبات مختلفة لإنتاج ناضجة ، وغير ناضجة ، والتهابات المطرد للدولة مثل نخاع العظم الخلايا الجذعية المستمدة الفئران في المختبر 3-7. هنا ، نقدم طريقة بسيطة لإنتاج الخلايا الجذعية الناضجة الفئران قادرة على صاروخ موجه لاستنزاف الغدد الليمفاوية بعد الحقن تحت الجلد ، وتقديم المستضد وتنشيط الخلايا التائية لقد غ. الخلية الجذعية الناتجة السكان عادة> CD11chigh 85 ٪ مع التعبير عن محرض على تفعيل CD80/86 LPS. إضافة TNF - للثقافة يوم 7 هو اختياري وتنتج phenotype8 أكثر نضجا. صون في المختبر انجرهانز الثقافات الخلية الجذعية ، TNF - ألفا هو عامل مهم ولكن البقاء على قيد الحياة لا يحفز الخلايا الناضجة 9. وتجدر الإشارة إلى أنه قد تم الإبلاغ عن TNF - ألفا من مصادر داخلية (خلايا انسجة الأرجح) ليكون حاضرا في الثقافة الإعلامية 7. طرق أخرى ناجحة للتصوير تحت الجلد حقن الخلايا الجذعية تشمل اختيار الإيجابية للخلايا + CD11c من الطحال وكذلك وضع العلامات المتزامنة وتنشيط الخلايا الجذعية الذاتية population1 ، 2 ، 10. انتاج الخلايا الجذعية CD11chigh من نخاع العظم هو وسيلة قوية تنتج باستمرار أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية قادرة على تقديم المستضد في الجسم الحي ، من المهم في التصوير عملية التكيف تنشيط الجهاز المناعي في 11 و 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
المعاهد الوطنية للصحة الزمالة زمالة Kirchstein predoctoral AI - 64128 (MPM) ، GM - 41514 (MDC) ، GM - 48071 (IP)
References
- Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J Exp Med. 200, 847-856 (2004).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).
- Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102, 1753-1763 (2003).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. 3, (2001).
- Winzler, C., et al. Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med. 185, 317-328 (1997).
- Koch, F., et al. Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation. J Exp Med. 171, 159-171 (1990).
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Wei, S. H., et al. Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node. J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).
- Castellino, F., et al. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
