Summary
돌기 세포에 의해 이차 림프 장기의 항원 프레 젠 테이션은 T 세포 적응 면역 반응을 중재의 개시를 위해 중요합니다. 여기서 우리는 골수의 문화 파생 murine 돌기 세포, 활성화 및 2 광자 이미징에 대한 라벨을 보여줍니다.
Abstract
murine 돌기 세포의 준비를 위해 여러 가지 방법이 문헌에서 찾을 수 있습니다. 여기, 우리는 문화에 이상 85% CD11c 높은 돌기 세포를 생산하는 방법을 제시 것을 피하 주입 및 항원 구체적인 T 세포 (동영상 참조) 현재 항원 후 배수 림프절의 고향. 또한, 우리는 일 10시 교양 세포의 형태가 성숙 돌기 세포와 세포의 <85% CD11chigh 아르의 전형이며, 돌기 세포 성숙을 추적하기 위해 에센 악기에게 Incucyte을 사용합니다. 2 - 광자 이미징에 의해 주변 림프절에 항원 프레 젠 테이션의 연구는 돌기 세포와 T 세포 상호 작용 1, 2의 세 개의 서로 다른 단계가있다는 것을 밝혔다. 페이즈 I는 매우 운동성이있는 특정 항원 T 세포와 돌기 세포 1, 2를 들고 항원 사이의 간단한 시리얼 연락처로 구성되어 있습니다. 차 두 항원에 특정한 T 세포와 돌기 세포 1, 2 베어링 항원 사이에 장시간 접촉에 의해 표시됩니다. 마지막으로, 단계 III는 운동성을 회복하고 1, 2,을 분할하기 시작, 돌기 세포에서 분리 T 세포에 의해 특징입니다. 이것은 항원 -로드 셀 추적 염료 분류 돌기 세포의 2 광자 영상으로 분석할 수 항원 특정 상호 작용의 유형의 한 예입니다.
Protocol
1) 쥐 한마리에서 모두 대퇴골의 뼈를 제거
- 근육 버려야하고 (무릎 및 고관절) 이상과 관절 아래의 대퇴골 뼈를 노출 해부 가위를 사용합니다. 해부의 족집게로 대퇴골의 중심을 파악하고 최대한 그대로 epiphysis의를 떠나 위의와 관절 아래 컷.
- 작은 해부 가위를 사용하여 가능한 한 많은 근육으로 닦아. RPMI 한 접시에 몽둥이를 전송합니다.
- 모든 절차는 무균 미디어, 악기, 피펫 팁 문화 요리를 사용하여,이 시점부터 후드에서 수행되어야합니다.
2) 대퇴골의 뼈를 소독 :
- 후드에서 RPMI에서 얼음에 70 % 에탄올로 가득 작은 문화 요리에 유골을 전송할 수 있습니다.
- 뼈가 얼음에 5 분 에탄올에 담그다 수 있습니다.
3) 무균 조건 하에서 골수를 수집합니다
- 무균 여과 기본 DC 문화 매체를 포함하는 작은 문화 요리에 유골을 전송합니다.
- 멸균 핀셋으로 폐기 접 관을 통해 뼈를 보유하고 멸균 가위로 (뼈의 종료) 각 epiphesis 잘라. 절단은 뼈의 중앙에 밝은 빨간색으로 골수를 노출해야합니다.
- 멸균 주사기 (26-28 게이지 바늘)으로 살균 미디어 100-200에 대해 ML을 빨아.
- 무균 미디어 신선한 음식을 통해 멸균 핀셋으로 뼈를 잡고 뼈의 한쪽에 바늘을 삽입합니다. 뼈 상단의 바늘의 끝 위치를 천천히 멸균 미디어 뼈를 씻으십시오. 당신이 뼈의 중심에있다면, 바늘은 쉽게 슬라이드한다.
- 골수는 작은 조각 또는 한 조각으로 역시 밖으로 씻는다. 그것은 뼈 및 살균 미디어의 그릇에 밖으로 플러시해야합니다.
- 완전히 뼈의 골수를 씻어 필요에 따라이 단계를 반복합니다.
- 뼈를 깨끗하게되면, 그것은 흰색과 반투명 것입니다.
- 다른 대퇴골 뼈이 절차를 반복합니다. 깨끗하게되면 각각의 대퇴부 뼈를 폐기하십시오.
4) 다시 일시 중지 및 골수 세포를 스핀 다운 :
- 멸균 팰컨 튜브에 세포를 전송합니다.
- 골수이 아직도 그대로있다면, 아주 부드럽게 단일 세포 현탁액으로 골수를 깨고, 접시에 미디어를 피펫 아래. 이것은 몇 분 정도 걸릴 수 있으며 깎아지른듯한 강제로 세포를 죽이는 않도록 천천히 이루어져야합니다.
- 어떤 다른 포유 동물 세포처럼 세포 원심 분리기.
5) 셀 용해 :
- 회전이 완료 후 원심 분리기에서 튜브를 제거하고 후드에있는 작은 쓰레기 (50 ML 팔콘 튜브)로 미디어에서 (가만히 따르다)를 부어.
- 부드럽게 튜브의 바닥을 flicking하여 Resuspend 펠릿.
- 무균 여과 물 10X DPBS 또는 10X PBS를 사용하여 다음 볼륨을 사용하여 적혈구 (RBCs)를 제거하는 물 용해를 수행 :
- 900 ML 무균 여과 물
- 100 ML 10X DPBS 또는 10X PBS
- 물을 추가한 후 10X PBS 50-10초 100 ML을 추가합니다. 그것은 즉시만을 RBCs가 lysed 것을 이렇게 매우 중요합니다. 그것은 두 pipettes 준비 채워 가지고하는 것이 좋습니다.
- 무균 DC 기본 미디어 10 ML - 5 ML을 추가합니다.
6) 셀 카운트 :
- 후드에서 부드럽게 약간 역전, 45도 기울기 (미디어 튜브의 상단을 접촉하지 않도록)와 튜브를 소용돌이 치는하여 골수 세포의 6-11 ML를 섞어
- 계산을위한 멸균 튜브에 미디어 10 ML를 제거합니다.
- 다시 모자 세포 원심 다시.
7) 도금 돌기 세포 :
- 전지는 1 X 106/mL의 밀도에 도금해야합니다.
- 도금에 대한 기본 DC 미디어의 해당 금액의 원심 분리기에서 세포, 가만히 따르다 미디어와 다시 중단 세포를 제거합니다.
- 조직 문화의 인큐베이터에 놓습니다.
8) 문화 케어 및 성숙 :
항상 더 많은 미디어를 추가하거나 실험에 사용하기 전에 문화를 확인하십시오. 세포의 일반적인 건강을 확인하고 잠재적인 오염을 찾습니다.
DAY 0 : 돌기 세포 도금.
DAY 3 : 미디어 비 adherant 세포의 75 %를 제거하고 다시 기본 DC 미디어를 추가합니다.
DAY 6 : 초기 셀 도금 후 다음 절차를 사용하여 다시 판 전지 :
- (당신은 자기편 세포가 건조하고 싶지 않아요) 매우 약간 서부 유럽 표준시 번호판을 떠나, 살균 50 ML 팔콘 튜브의 일부가 아닌 adherant이 시점에서 DC가, 장소를 포함한다 미디어를 제거
- 각 플레이트에 PBS 3 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)을 추가하고 5 분 앉아 수 있습니다.
- 45도 각도에서 접시를 잡고 부드럽게 부드럽게 비 adherant 세포를 이동시키다하는 접시의 바닥에 대한 미디어를 피펫 아래.
- EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) / PBS는 두껍게 나타내는 세포의 바닥에서 수집되는 되야지판.
- 이 몇 분 후에 세포 혼합물은 50 ML 팔콘 튜브로 전송하실 수 있습니다.
- 각 플레이트에 대해이 절차를 수행한 후 모든 셀을 스핀.
- 1 밀도에 카운트 및 플레이트 세포 X 10 ^ 새로운 살균 10cm 문화 요리 보조 DC 미디어 6 회 판. 조직 문화의 인큐베이터로 세포를 반환합니다.
DAY 10-11
자극 / 항원 로딩 준비 성숙 DC가.
9) 돌기 세포 자극 :
- 활성화 및 펩티드 로딩을 위해 원하는 펩타이드와 함께 LPS를 (lipopolyscaccharide)를 사용합니다. LPS의 소스에 따라 서로 다른 자극 조건은 더 나은 결과를 제공할 수 있습니다. 또한, DC 프레 젠 테이션을 위해 펩타이드의 원하는 금액을 최적화해야합니다. 이 프로토콜의 자극 조건은 100 NG / ML LPS 100 UG / ML OVA (ovalbumin)되었습니다.
- 로드 항원 / 사전 수확 18-24시간에 대한 LPS와 치료 / 사용합니다.
돌기 세포 미디어 : 모든 후 무균 필터가 추가되었습니다
다른 돌기 세포 배양 조건을 검토하고 그 결과 돌기 세포 표현형에 대한 토론 섹션을 참조하십시오. 이러한 문화 조건이 성숙 돌기 세포를 생산하도록 설계되는 급속 18~24시간 피하 주사하고 효율적으로 현재의 항원 후 배수 림프절에 집.
기본 DC 미디어 : 모든 후 무균 필터가 추가되었습니다
- 500 ML IMDM (500mL 최종 볼륨 55-60 ML 제거)
- 50 ML 열 inactivated FBS
- 200 MM L - Gln, 2 mm의 최종 농도 5 ML
- 100 IU / ML 페니실린과 100 MG / ML 스트렙토 마이신 (10,000 IU / ML 펜 및 만 MG / ML Strep 주식 5 ML)
- 50 음 B - 나 (14.3 M B - 내 물건은 화학 후드에 1:100을 희석, 50 micromolar 집중력 100 ML 미디어 당 35 UL 사용)
- 20-30 NG / ML GM - CSF
- 100-400 IU / ML IL - 4 약 10-40 NG / ML
성숙의 *에 대한 SecondaryDC 미디어
100 NG / ML TNF - 알파 (기본 DC 미디어에 추가)
* 참고 : GM - CSF + IL - 4는 어려서 돌기 세포를 생산한다. GM - CSF를 사용하여 + IL4 (400 IU / UL) + TNF - 알파 (100 UG / ML)은 성숙 단핵구 파생 돌기 세포 유사 세포를 생성합니다. 중년 여인 돌기 세포는 미숙 돌기 세포와 문화가 내생 TNF - stromal 세포에서 출시 4 수 있습니다 한한 효율적으로 항원을 차지하지 알려져 있습니다.
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Discussion
돌기 세포는 적응 면역 반응과 날짜에 특징이 가장 효율적인 항원 제시 세포의 핵심 중재자입니다. 문학 인간 및 마우스의 돌기 세포 배양을위한 방법은 다른 돌기 세포 유형의 발전에 영향을 미치는 데 사용 크린 시토킨의 종류에 차이가 있습니다. 특히, GM - CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF - 알파와 IFN - 감마는 성숙 미숙, 염증 및 정상 상태 체외 3-7에서 돌기 세포를 파생 murine 골수와 같은 생산하는 다른 조합에 사용됩니다. 여기, 우리는 능력이 성숙 murine 돌기 세포의 생산을위한 간단한 방법을 제시 유도, 피하 주사 후 림프절을 고갈 T 세포를하신 나 항원 및 활성화를 제시합니다. 그 결과 돌기 세포 인구는 일반적으로 LPS 활성화시 CD80/86의 inducible 표현과 함께> 85 % CD11chigh입니다. 일 7 문화 TNF - 의 추가는 선택 사항이며보다 성숙한 phenotype8을 생산하고 있습니다. 체외 Langerhans 돌기 세포 배양에의 유지 보수, TNF - 알파는 중요한 생존 요소이지만 9 성숙하는 세포를 자극하지 않습니다. 그것은 내생 소스에서 TNF - 알파 (가능성이 stromal 세포)가 문화 미디어 7 존재하는 것으로보고되었습니다 것을인지해야합니다. 이미징 다른 성공적인 방법은 subcutaneously 주입 돌기 세포가 비장에서 CD11c + 세포에 대한 긍정적인 선택뿐만 아니라 내생 돌기 세포의 동시 라벨 부착 및 활성화 population1, 2, 10를 포함합니다. 골수에서 CD11chigh 돌기 세포의 생산은 지속적으로 이미징 적응 면역 시스템 활성화 11, 12의 과정에 중요한 생체내의 항원 프레 젠 테이션 능력이 돌기 세포의 큰 숫자를 생산하는 강력한 방법입니다.
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Acknowledgments
건강 Kirchstein 원정대 predoctoral 교제 AI - 64128 (MPM), GM - 41514 (MDC), GM - 48071 (IP)의 국립 연구소
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