Geração de Medula Óssea Derivado Células Dendríticas murino para uso em dois fótons de imagem

Summary

Apresentação de antígenos em órgãos linfóides secundários pelas células dendríticas é crucial para o início da célula T mediada resposta imune adaptativa. Aqui demonstramos a cultura de medula óssea células dendríticas derivadas de camundongos, ativação e de rotulagem para os dois fótons de imagem.

Abstract

Vários métodos para a preparação de células dendríticas murinas podem ser encontrados na literatura. Aqui, apresentamos um método que produz mais de 85% CD11c alta células dendríticas em cultura que abriga o linfonodo de drenagem após a injecção subcutânea e antígeno presente nas células T antígeno específico (ver vídeo). Além disso, usamos instrumentos Essen Incucyte para acompanhar a maturação de células dendríticas, onde, no dia 10, a morfologia das células em cultura é típica de uma célula madura dendríticas e% <85 de células são CD11chigh. O estudo da apresentação de antígenos nos linfonodos periféricos por dois fótons de imagem revelou que há três fases distintas de células dendríticas e interação célula T ^{1, 2.} A Fase I consiste de breves contatos serial entre altamente móveis antígeno de células T específicas eo antigénio transportando células dendríticas ^{1, 2.} A fase dois é marcado por contatos prolongados entre antígeno-específica de células T e células dendríticas antígeno tendo ^{1, 2.} Finalmente, a fase III é caracterizada por células T destacando a partir de células dendríticas, recuperando a mobilidade e começam a dividir ^{1, 2.} Este é um exemplo do tipo de antígeno específico interações que podem ser analisados ​​por dois fótons de imagem de antígeno de células-carregados rastreador dye-rotulados células dendríticas.

Protocol

1) Remova os dois ossos do fêmur de um rato

1. Use uma tesoura para cortar dissecção muscular e expor o osso fêmur acima e abaixo das articulações (joelho e quadril). Segure o centro do fêmur com uma pinça de dissecção e cortar acima e abaixo das articulações para deixar o máximo de epífise intacta possível.
2. Limpar tanto músculo quanto possível, utilizando uma tesoura de dissecção de pequeno porte. Transferência do fêmur em um prato de RPMI.
3. Todos os procedimentos devem ser realizados na capa a partir deste ponto, utilizando apenas meios estéreis, instrumentos, ponteiras e placas de cultura.

2) Esterilizar os ossos do fêmur:

1. Na capa, a transferência de ossos da RPMI para um prato de cultura pequeno enchido com etanol a 70% sobre o gelo.
2. Permitir que os ossos de molho em álcool por 5 minutos no gelo.

3) Recolha de medula óssea em condições estéreis:

1. Transferência de ossos para um prato de cultura contendo pequenas estéril filtrado meios de cultura primária DC.
2. Com uma pinça estéril, segure o osso sobre um prato descartar ou tubo, e com uma tesoura esterilizada, cortar cada epiphesis (extremidades do osso) para fora. O corte deve expor a medula óssea que é vermelho brilhante no centro do osso.
3. Com uma seringa estéril (26-28 agulha), sugam cerca de 100-200 mL de meios estéreis.
4. Segurar o osso com a pinça estéril sobre um prato de doce de mídia estéril e inserir a agulha em um lado do osso. A posição da ponta da agulha perto do topo do osso e, lentamente, lavar o osso com a mídia estéril. Se você está no centro do osso, a agulha deve deslizar facilmente.
5. A medula óssea lava para fora, seja em pequenos pedaços ou como uma peça única. Ele deve ser empurrado para fora do osso e no prato de mídia estéril.
6. Repita essa etapa conforme necessário para lavar completamente a medula do osso.
7. Quando o osso está limpo, ele será branco e translúcido.
8. Repita este procedimento com o osso fêmur outros. Descartar cada osso do fêmur, uma vez que está limpo.

4) Re-suspender e girar as células da medula óssea:

1. Transferência de células para um tubo falcon estéril.
2. Se a medula ainda está intacto, muito gentilmente pipeta media cima e para baixo no prato, para quebrar a medula em uma suspensão de células individuais. Isto pode levar alguns minutos e deve ser feito lentamente para evitar matar as células por pura força.
3. Células centrífuga como faria com qualquer outras células de mamíferos.

5) Lise Celular:

1. Retire o tubo da centrífuga, após o spin é feito e despeje mídia off (decantar) em um desperdício pequenos (50 mL tubo falcon) na capa.
2. Ressuspender suavemente flicking pellet no fundo do tubo.
3. Utilizando água filtrada estéril e DPBS 10x ou 10x PBS, realizar uma lise de água para remover as células vermelhas do sangue (hemácias), utilizando os seguintes volumes:
   • 900 mL de água estéril filtrado
   • 100 mL DPBS 10x ou 10x PBS
4. Adicionar 100 mL de segundos 10x PBS 10/05 após a adição da água. É muito importante fazer isso imediatamente, para que apenas as hemácias são lisadas. É uma boa idéia ter as duas pipetas cheio e pronto.
5. Adicionar 5 mL - 10 mL de estéril media DC básica.

6) contagem de células:

1. Na capa, o mix mL 6-11 de células da medula óssea rodando suavemente o tubo com uma ligeira inversão, uma inclinação de 45 graus (não para que a mídia toca o topo do tubo)
2. Retire 10 mL dos meios de comunicação em um tubo estéril para contar.
3. Feche as células e centrifugar novamente.

7) células dendríticas Plating:

1. As células devem ser banhados com uma densidade de 1 x 106/mL.
2. Remove as células de centrífuga, a mídia decantar e re-suspensão em células a quantidade adequada de mídia primária DC para revestimento.
3. Lugar na cultura de tecidos incubadora.

8) Cuidado Cultura e Maturação:

Sempre verifique culturas antes de adicionar mais mídia ou utilizar em qualquer experimentos. Verifique o estado geral de saúde das células e olhar para a contaminação potencial.

DIA 0: As células dendríticas banhado.

DIA 3: Remove 75% dos meios de comunicação e não adherant células e adicionar mídia primária de volta DC.

DIA 6: Depois de Plating célula inicial: Re placa-as células usando o seguinte procedimento:

1. Remova a mídia, que deve conter alguns DCs não adherant neste momento, e colocar em um tubo de 50 mL estéreis falcão, deixando as placas ligeiramente úmido (você não quer que as células aderentes a secar)
2. Adicione 3 mM EDTA em PBS para cada prato e deixe descansar por 5 minutos.
3. Segure a placa em um ângulo de 45 graus e gentilmente pipeta mídia para cima e para baixo contra a parte inferior da placa gentilmente desalojar não adherant células.
4. EDTA / PBS deve tornar-se mais espessa, indicando as células estão sendo coletados a partir do fundo doprato.
5. Depois de alguns minutos disso, a mistura de células pode ser transferido para o tubo de 50 mL falcon.
6. Girar todas as células, após esse procedimento para cada prato.
7. Contagem e placa de as células a uma densidade de 1 x 10 ^ 6 por placa no Media Secundária DC em novas placas de cultura estéril 10 cm. Retorno células para cultura de tecidos incubadora.

DIA 11/10

DCs maduras prontas para a estimulação / antígeno de carga.

9) estimulação das células dendríticas:

1. Use LPS (lipopolyscaccharide) em combinação com peptídeo desejado para a activação e carregamento de peptídeo. Dependendo da sua fonte de LPS, condições de estimulação diferentes poderão dar melhores resultados. Além disso, a quantidade desejada de peptídeo para apresentação DC deve ser otimizado. Condições de estimulação neste protocolo foram 100 ng / mL e 100 LPS OVA ug / mL (ovalbumina).
2. Antígeno carga / tratar com LPS por 18-24 horas antes da colheita / utilização.

Mídia células dendríticas: filtro estéril depois de tudo ter sido adicionado

Por favor, consulte a seção de discussão para uma revisão de diferentes condições de cultura de células dendríticas e para o fenótipo resultante célula dendrítica. Estas condições de cultivo são projetados para produzir células dendríticas maduras que rapidamente se casa para os linfonodos de drenagem, 18-24 horas após a injecção subcutânea e antígeno presente de forma eficiente.

DC primário Media: filtro estéril depois de tudo ter sido adicionado

• 500 mL IMDM (remove 55-60 mL de volume final de 500mL)
• 50 mL de calor FBS inativada
• 5 mL de 200 mM L-Gln, concentração final de 2 mM
• 100 UI / ml de penicilina e estreptomicina 100 mg / mL (5 mL de 10.000 Pen IU / mL e 10.000 mg / mL de ações Strep)
• 50 uM B-Me (14,3 M estoque B-Me, diluir 1:100 na capa químicos, use 35 ul por 100 mL de mídia para concentração de 50 micromolar)
• 20-30 ng / mL GM-CSF
• 100-400 UI / mL IL-4 cerca de 10-40 ng / mL

* Media SecondaryDC para maturação

100 ng / mL TNF-alfa (add to primário DC media)

* Nota: GM-CSF + IL-4 deve produzir células dendríticas imaturas. Usando GM-CSF + IL4 (400 UI / ul) + TNF-alfa (100 ug / mL) irá criar células que se assemelham madura monócitos derivados células dendríticas. Células dendríticas maduras são conhecidos por não levar até o antígeno de forma tão eficiente como células dendríticas imaturas e culturas pode ter endógena TNF-a liberados a partir de células do estroma ^4.

Discussion

As células dendríticas são mediadores-chave da resposta imune adaptativa ea célula mais eficiente do antígeno apresentando caracterizada até o momento. Métodos para humanos e cultura de células dendríticas do mouse na literatura diferem no tipo de citocinas usadas para influenciar o desenvolvimento de diferentes tipos de células dendríticas. Nomeadamente, a GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa e IFN-gama são utilizadas em diferentes combinações para produzir maduros, imaturos, inflamatórias e steady-state, como medula óssea de camundongos células dendríticas derivadas in vitro ^3-7. Aqui, apresentamos um método simples para a produção de células dendríticas maduras murino que são capazes de homing para linfonodos drenantes após a injeção subcutânea, apresentando antígeno e ativando as células T nd ve. A população de células dendríticas é tipicamente resultando> CD11chigh 85% com a expressão indutível de CD80/86 na ativação LPS. A adição de TNF- à cultura no dia 7 é opcional e produz um phenotype8 mais maduro. A manutenção de culturas in vitro de células dendríticas de Langerhans, TNF-alfa é um fator importante de sobrevivência, mas não estimular o amadurecimento das células ^9. Note-se que o TNF-alfa a partir de fontes endógenas (provavelmente células do estroma) tem sido relatada a estar presente na cultura da mídia ^7. Outros métodos bem sucedidos para a imagem latente subcutânea de células dendríticas incluem seleção positiva de células CD11c + do baço, bem como a rotulagem concorrentes e ativação da célula dendrítica endógena ^{população1, 2, 10.} Produção de células dendríticas CD11chigh da medula óssea é um método robusto que consistentemente produz um grande número de células dendríticas capaz de apresentação de antígenos in vivo, importante na imagem do processo de ativação do sistema imune adaptativo ^{11, 12.}