Generazione di cellule derivate dal midollo osseo dendritiche murini per l'uso in 2-fotone Imaging

Summary

Presentazione dell'antigene in organi linfatici secondari da parte delle cellule dendritiche è cruciale per l'avvio della cellula T mediata risposta immunitaria adattativa. Qui mostriamo la cultura del midollo osseo derivate le cellule dendritiche murine, di attivazione e di etichettatura per 2-fotoni imaging.

Abstract

Diversi metodi per la preparazione di cellule dendritiche murine possono essere trovati in letteratura. Qui, vi presentiamo un metodo che produce più del 85% CD11c cellule dendritiche in alta cultura che ospita il linfonodo drenante dopo iniezione sottocutanea e antigene presente a cellule T antigene specifico (vedi video). Inoltre, utilizziamo strumenti Essen Incucyte per monitorare la maturazione delle cellule dendritiche, dove, al giorno 10, la morfologia delle cellule in coltura è tipico di una cellula matura dendritiche e <85% delle cellule sono CD11chigh. Lo studio di presentazione dell'antigene nei linfonodi periferici da 2-fotone di imaging ha rivelato che ci sono tre fasi distinte di cellule dendritiche e l'interazione delle cellule T ^{1, 2.} Fase I è costituito da brevi contatti seriale tra altamente mobili cellule T antigene specifico antigene e portando le cellule dendritiche ^{1, 2.} La fase due è segnato da contatto prolungato tra antigene-specifica delle cellule T antigene e cuscinetti cellule dendritiche ^{1, 2.} Infine, di fase III è caratterizzata da cellule T distacco dalle cellule dendritiche, recuperare la motilità e l'inizio di dividere ^{1, 2.} Questo è un esempio del tipo di antigene-specifiche interazioni che possono essere analizzati da due fotoni di imaging di antigene-caricati celle dye-inseguitore etichettati cellule dendritiche.

Protocol

1) Rimuovere entrambe le ossa di femore da un topo

1. Usare le forbici per tagliare via la dissezione dei muscoli ed esporre l'osso del femore sopra e sotto le articolazioni (ginocchio e anca). Afferrare il centro del femore con una pinzetta dissezione e taglio sopra e sotto le articolazioni di lasciare il più delle epifisi intatto possibile.
2. Pulire i muscoli il più possibile con le forbici la dissezione di piccole dimensioni. Trasferire il femore in un piatto di RPMI.
3. Tutte le procedure devono essere effettuate nel cappuccio da questo punto in poi, utilizzando solo mezzi sterili, strumentazione, pipette e piatti della cultura.

2) Sterilizzare le ossa del femore:

1. Nel cofano, il trasferimento delle ossa dal RPMI a un piatto pieno di cultura piccolo etanolo al 70% su ghiaccio.
2. Lasciare a bagno le ossa in etanolo per 5 minuti in ghiaccio.

3) Raccogliere midollo osseo in condizioni sterili:

1. Trasferire le ossa di un piatto cultura piccolo contenente sterile filtrata primaria terreni di coltura DC.
2. Con una pinzetta sterile, tenere l'osso su un piatto scartare o un tubo, e con le forbici sterili, tagliare ogni epiphesis (le estremità delle ossa) al largo. Il taglio dovrebbe esporre il midollo osseo, che è rosso brillante al centro dell'osso.
3. Con una siringa sterile (26-28 gauge), aspirare circa 100-200 ml di media sterile.
4. Tenere l'osso con la pinzetta sterile su un piatto fresco di media sterile e inserire l'ago in un lato del tessuto osseo. Posizionare la punta dell'ago vicino alla parte superiore delle ossa e lentamente lavare l'osso con i media sterile. Se si è al centro delle ossa, l'ago deve scorrere con facilità.
5. Il midollo osseo sbiadisce, sia in piccoli pezzi o come un pezzo unico. Va lavata delle ossa e nel piatto dei media sterile.
6. Ripetere questo passaggio come necessario per lavare completamente il midollo delle ossa.
7. Quando l'osso è pulito, sarà bianca e trasparente.
8. Ripetete questa procedura con l'osso del femore altri. Eliminare ogni osso del femore, una volta che sia pulito.

4) Re-Spin sospendere e le cellule di midollo osseo:

1. Trasferire le cellule in una provetta sterile falco.
2. Se il midollo è ancora intatto, molto delicatamente pipetta multimediali su e giù nel piatto, per rompere il midollo in una sospensione di cellule singole. Questa operazione potrebbe richiedere alcuni minuti e dovrebbe essere fatto lentamente per evitare di uccidere le cellule con la forza pura.
3. Cellule centrifuga come qualsiasi altre cellule di mammifero.

5) cellule Lysis:

1. Rimuovere il tubo dalla centrifuga dopo lo spin è fatto e versare mezzi di comunicazione off (decantare) in un piccoli rifiuti (50 ml di tubo di falco) nel cappuccio.
2. Risospendere il pellet con delicatezza sfogliando il fondo della provetta.
3. Usando acqua sterile filtrata e DPBS 10x o 10x PBS, effettuare una lisi acqua per rimuovere i globuli rossi (RBC), utilizzando i seguenti volumi:
   • 900 ml di acqua sterile filtrata
   • 100 ml DPBS 10x o 10x PBS
4. Aggiungere 100 ml di PBS 10x secondo 50-10 dopo aver aggiunto l'acqua. E 'molto importante fare questo immediatamente in modo che solo i globuli rossi vengono lisati. E 'una buona idea avere entrambe le pipette pieno e pronto.
5. Aggiungere 5 ml - 10 ml di sterili DC supporti di base.

6) Conteggio di celle:

1. Nel cofano, mescolare 6 al 11 mL di cellule del midollo osseo rimestando delicatamente il tubo con una leggera inversione, una inclinazione di 45 gradi (non così che i media tocca la parte superiore del tubo)
2. Rimuovere 10 ml di media in una provetta sterile per il conteggio.
3. Richiudere le cellule e centrifugare di nuovo.

7) Placcatura cellule dendritiche:

1. Le cellule devono essere placcato ad una densità di 1 x 106/ml.
2. Rimuovere le cellule da centrifuga, media decantare e risospendere le cellule in quantità appropriata di primaria media DC per la placcatura.
3. Luogo nel tessuto della cultura incubatore.

8) Cura Cultura e Maturazione:

Controllare sempre le culture prima di aggiungere altri mezzi di comunicazione o utilizzando in qualsiasi esperimenti. Controllare la salute generale delle cellule e cercare potenziale contaminazione.

GIORNO 0: le cellule dendritiche placcato.

GIORNO 3: Rimuovere il 75% dei media e non adherant celle e aggiungere di nuovo primario dei media DC.

6 ° GIORNO: Dopo Placcatura cella iniziale: Re-plate le cellule con la seguente procedura:

1. Rimuovere i supporti, che dovrebbe contenere alcuni non-adherant DC a questo punto, e mettere in un tubo da 50 ml sterile falco, lasciando le piastre leggermente umido (non volete le cellule aderenti ad asciugare)
2. Aggiungere 3 mM EDTA in soluzione salina in ogni piatto e lasciar riposare per 5 minuti.
3. Tenere il piatto in un angolo di 45 gradi e delicatamente pipetta dei media su e giù contro il fondo del piatto per rimuovere delicatamente non adherant cellule.
4. EDTA / PBS deve diventare più spessa cellule che indicano vengono raccolti dal fondo delpiatto.
5. Dopo alcuni minuti di questo, miscela di cellule possono essere trasferiti al tubo 50 ml falco.
6. Spin tutte le cellule dopo aver eseguito questa procedura per ogni piatto.
7. Conte e la piastra le cellule ad una densità di 1 x 10 ^ 6 per ogni piastra in media secondaria DC in nuovi piatti sterile 10 centimetri cultura. Ritorno alle cellule di tessuto cultura incubatrice.

DAY 10-11

DC maturo pronto per la stimolazione / antigene di carico.

9) La stimolazione delle cellule dendritiche:

1. Usa LPS (lipopolyscaccharide) in combinazione con il peptide desiderato per l'attivazione e il caricamento del peptide. A seconda della fonte di LPS, diverse condizioni di stimolazione può dare risultati migliori. Inoltre, la quantità desiderata di peptidi per la presentazione DC devono essere ottimizzate. Condizioni di stimolo in questo protocollo sono stati 100 ng / ml LPS e 100 ug / mL OVA (ovoalbumina).
2. Antigene di carico / trattare con LPS per 18-24 ore prima del raccolto / uso.

Media dendritiche Cell: filtro sterile dopo tutto è stata aggiunta

Si prega di consultare la sezione di discussione per una revisione delle condizioni delle cellule dendritiche diverse culture e per il fenotipo risultante delle cellule dendritiche. Queste condizioni di coltura sono stati progettati per produrre mature cellule dendritiche che a casa rapidamente ai linfonodi drenanti, 18-24 ore dopo l'iniezione sottocutanea e l'antigene presente in modo efficiente.

Primaria DC Media: filtro sterile dopo tutto è stata aggiunta

• 500 ml IMDM (togliere 55-60 ml per 500mL volume finale)
• 50 ml di calore FBS inattivato
• 5 ml di 200 mM di L-Gln, concentrazione finale di 2 mM
• 100 UI / ml di penicillina e 100 mg / mL di streptomicina (5 ml di 10.000 UI / ml Pen e 10.000 mg / mL magazzino Strep)
• 50 uM B-Me (14,3 M B-Me magazzino, diluire 1:100 in cappa chimica, utilizzare 35 ul per 100 ml per 50 mezzi Dosi micromolari)
• 20-30 ng / mL GM-CSF
• 100-400 UI / mL di IL-4 di circa 10-40 ng / mL

Mezzi di comunicazione per SecondaryDC * maturazione

100 ng / mL TNF-alfa (aggiungere alla primaria DC media)

* Nota: GM-CSF + IL-4 dovrebbe produrre cellule dendritiche immature. Utilizzando GM-CSF + IL4 (400 UI / ul) + TNF-alfa (100 ug / ml) creerà le cellule che assomigliano mature monociti cellule dendritiche derivate. Mature cellule dendritiche sono noti per non prendere l'antigene nel modo più efficiente le cellule dendritiche immature e le culture possono essere endogeni TNF-alfa rilasciata dalle cellule stromali ^4.

Discussion

Le cellule dendritiche sono mediatori chiave della risposta immunitaria e la cellula che presenta l'antigene più efficiente caratterizzato fino ad oggi. Metodi per l'uomo e topo di cellule dendritiche cultura in letteratura si differenziano per il tipo di citochine usato per influenzare lo sviluppo di diversi tipi di cellule dendritiche. In particolare, GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa e IFN-gamma sono utilizzati in diverse combinazioni per produrre maturo, immaturo, infiammatorie e lo stato stazionario come il midollo osseo murino, cellule dendritiche derivate in vitro ^3-7. Qui, vi presentiamo un metodo semplice per la produzione di cellule dendritiche murine mature, capaci di homing al linfonodo drenante dopo iniezione sottocutanea, presentando l'antigene e l'attivazione di cellule T na ve. La risultante popolazione di cellule dendritiche è tipicamente CD11chigh> 85% con l'espressione inducibile di CD80/86 all'attivazione LPS. L'aggiunta di TNF- alla cultura il giorno 7 è facoltativo e produce un più maturo phenotype8. Il mantenimento di culture dendritiche in vitro delle cellule di Langerhans, TNF-alfa è un importante fattore di sopravvivenza, ma non stimolare le cellule a maturare ^9. Va notato che il TNF-alfa da fonti endogene (probabilmente cellule stromali) è stato segnalato per essere presente nella cultura dei media ^7. Altri metodi di successo per l'imaging per via sottocutanea cellule dendritiche includono la selezione positiva per le cellule CD11c + dalla milza così come l'etichettatura concorrente e l'attivazione delle cellule dendritiche endogeno ^{population1, 2, 10.} Produzione di cellule dendritiche CD11chigh dal midollo osseo è un metodo affidabile che produce sempre un gran numero di cellule dendritiche in grado di presentazione dell'antigene in vivo, importante nella diagnostica per immagini del processo di attivazione del sistema immunitario adattativo ^{11, 12.}