Generering av benmärg härledda Murine dendritiska celler för användning i 2-fotonen Imaging

Summary

Antigen presentation i sekundära lymfoida organ av dendritiska celler är avgörande för inledandet av T-cells medierade adaptiva immunsvaret. Här kan vi visa på kulturen i benmärgen härrör murina dendritiska celler, aktivering och märkning för 2-photon avbildning.

Abstract

Flera metoder för beredning av murina dendritiska celler kan hittas i litteraturen. Här presenterar vi en metod som ger mer än 85% CD11c stora dendritiska celler i kultur som hem till dränerande lymfkörteln efter subkutan injektion och presentera antigen för att antigen specifika T-celler (se video). Dessutom använder vi Essen Instruments Incucyte att spåra dendritiska celler mognad, där, på dag 10, är ​​morfologi av de odlade cellerna typiska för en mogen dendritiska celler och <85% av celler CD11chigh. Studien av antigen presentation i perifera lymfkörtlar med 2-fotonen imaging visade att det finns tre distinkta faser av dendritiska celler och T-cell interaktion ^{1, 2.} Fas I består av korta seriella kontakter mellan mycket rörliga antigen specifika T-celler och antigen bär dendritiska celler ^{1, 2.} Fas två präglas av långvarig kontakt mellan antigen-specifika T-cell och antigen bärande dendritiska celler ^{1, 2.} Slutligen är fas III kännetecknas av T-celler lossnar från dendritiska celler, återfå rörlighet och börjar dela ^{1, 2.} Detta är ett exempel på den typ av antigen-specifika interaktioner som kan analyseras med två-photon avbildning av antigen-laddad cell tracker dye-märkta dendritiska celler.

Protocol

1) Ta bort båda lårbenet ben från en mus

1. Använd dissekering sax för att klippa bort muskler och exponera lårbenet benet ovanför och nedanför leder (knä och höft). Ta tag i mitten av lårbenet med dissektion pincett och skär över och under lederna för att lämna så mycket av epifysen intakt som möjligt.
2. Torka bort så mycket muskler som möjligt med hjälp av små dissektion sax. Överför lårbenet i ett fat RPMI.
3. Alla procedurer bör genomföras i luvan från och med nu att bara använda sterila media, instrument, tips pipett och mat kultur.

2) Sterilisera lårben ben:

1. I huven, överföring ben från RPMI till en liten kultur tallrik fylld med 70% etanol på is.
2. Låt ben att suga i etanol i 5 minuter på is.

3) Samla benmärg under sterila förhållanden:

1. Överför ben till en liten kultur maträtt innehållande steril filtreras Primär DC kultur media.
2. Med steril pincett, håll benet över en släng maträtt eller rör och med steril sax, skär varje epiphesis (ändar av ben) av. Snittet bör utsätta benmärgen som är klarröd i mitten av benet.
3. Med en steril spruta (26-28 gauge nål), suga upp ca 100-200 ml steril media.
4. Håll benet med den sterila pincett över en ny maträtt av sterila media och för in kanylen i ena sidan av benet. Placera nålspetsen nära toppen av benet och långsamt tvätta benet ut med sterila media. Om du är i mitten av benet, bör nålen glida in lätt.
5. Benmärgen tvättar ut, antingen i små bitar eller som ett enda stycke. Det bör spolas ut ur benet och i skålen med steril media.
6. Upprepa detta steg som behövs för att helt tvätta märg ur benet.
7. När benet är ren, kommer det att vara vit och genomskinlig.
8. Upprepa proceduren med den andra lårbenet ben. Kasta varje lårben ben när den är ren.

4) Återuppslamma och spinn ner benmärgsceller:

1. Överför cellerna till en steril falk rör.
2. Om benmärgen är fortfarande intakt, mycket försiktigt pipettera media upp och ner i skålen, att bryta upp benmärg till en enda cellsuspension. Detta kan ta flera minuter och bör göras långsamt för att undvika att döda celler genom ren kraft.
3. Centrifugera cellerna som du skulle alla andra däggdjursceller.

5) cellslys:

1. Ta bort röret från centrifugen efter utdelningen är klar och häll media av (dekantera) i en liten avfall (50 ml Falcon rör) i huven.
2. Resuspendera pellet genom att försiktigt vicka botten av röret.
3. Använda sterilt filtrerat vatten och 10x DPBS eller 10x PBS, genomföra en vatten-lys för att ta bort de röda blodkropparna (RBK) med följande volymer:
   • 900 ml sterilt filtrerat vatten
   • 100 ml 10x DPBS eller 10x PBS
4. Tillsätt 100 ml 10x PBS 5-10 sekunder efter tillsättning av vatten. Det är mycket viktigt att göra detta omedelbart så att bara de röda blodkropparna lyseras. Det är en bra idé att ha både pipetter fyllda och redo.
5. Tillsätt 5 ml - 10 ml sterilt DC grundläggande medier.

6) Räkna celler:

1. I huven, blanda 6 till 11 ml benmärgsceller genom att försiktigt snurra röret med en lätt inversion, en 45 graders lutning (inte så att media vidrör toppen av röret)
2. Ta 10 ml av media i ett sterilt rör för räkning.
3. Re-cap cellerna och centrifugera igen.

7) Plating dendritiska celler:

1. Celler bör vara klädd vid en densitet av 1 x 106/mL.
2. Ta bort celler från centrifugering, dekantera media och återsuspendera cellerna i lämplig mängd primär DC Media för plätering.
3. Placera i vävnadskultur kuvös.

8) Kultur Skötsel och mognad:

Kontrollera alltid kulturer innan du lägger till fler medier eller använda i något experiment. Kontrollera den allmänna hälsan hos celler och leta efter eventuella föroreningar.

Dag 0: Dendritic celler klädd.

DAG 3: Ta bort 75% av medier och icke-adherant celler och lägga tillbaka Primär DC medier.

DAG 6: Efter inledande Cell Plating: Re-platta celler på följande sätt:

1. Ta ut materialet, som bör innehålla några icke-adherant DC på denna punkt, och placera i en steril 50 ml Falcon rör och lämnar plattor aningen blöt (du inte vill att anhängare cellerna att torka ut)
2. Tillsätt 3 mM EDTA i PBS till varje tallrik och låt sitta i 5 minuter.
3. Håll plattan i 45 graders vinkel och försiktigt pipettera media upp och ner mot botten av plattan för att försiktigt få bort icke-adherant celler.
4. EDTA / PBS bör bli tjockare indikerar celler som samlas in från botten avplattan.
5. Efter flera minuter av detta, kan cellen blandningen överförs till 50 ml Falcon rör.
6. Spin alla celler efter den här proceduren för varje platta.
7. Räkna och platta celler vid en densitet av 1 x 10 ^ 6 per platta i Sekundär DC Media i ny steril 10 rätter cm kultur. Återgå celler till vävnadskultur inkubator.

Dag 10-11

Mogna DCs redo för stimulering / antigen lastning.

9) dendritiska celler stimulering:

1. Använd LPS (lipopolyscaccharide) i kombination med önskad peptid för aktivering och peptid lastning. Beroende på din källa till LPS, kan särskilda stimulans förutsättningar att ge bättre resultat. Dessutom bör önskad mängd peptid för DC-presentation optimeras. Stimulering villkor i detta protokoll var 100 ng / ml LPS och 100 ug / ml ägg (äggalbumin).
2. Ladda antigen / behandla med LPS i 18-24 timmar före skörd / använda.

Dendritiska celler Media: sterilfilter efter allt har lagts

Se diskussionen avsnitt för en genomgång av olika dendritiska villkor cellkultur och för den resulterande dendritiska celler fenotyp. Dessa odlingsbetingelser har utformats för att producera mogna dendritiska celler som snabbt hem till dränering lymfkörtlar, 18-24 timmar efter subkutan injektion och presentera antigen effektivt.

Primär DC Media: sterilfilter efter allt har lagts

• 500 ml IMDM (ta bort 55-60 mL för 500ml slutlig volym)
• 50 ml värmeinaktiverad FBS
• 5 mL av 200 mM L-GLN, slutlig koncentration av 2 mm
• 100 IU / ml penicillin och 100 mg / ml streptomycin (5 ml av 10.000 IU / ml Pen och 10.000 mg / ml Strep lager)
• 50 um B-Me (14,3 M B-Me lager, späd 1:100 i kemiska huva, använder 35 ul per 100 ml media för 50 mikromolära koncentration)
• 20-30 ng / ml GM-CSF
• 100-400 IU / ml IL-4 ungefär 10 till 40 ng / ml

SecondaryDC media för mognad *

100 ng / ml TNF-alfa (lägg till Primär DC medier)

* Obs: GM-CSF + IL-4 ska ge omogna dendritiska celler. Använda GM-CSF + IL4 (400 IE / ul) + TNF-alfa (100 ug / ml) kommer att skapa celler som liknar mogna monocyt härledda dendritiska celler. Mogna dendritiska celler är kända för att inte ta upp antigen så effektivt som omogna dendritiska celler och kulturer kan ha endogena TNF-a frigörs från stromaceller ^4.

Discussion

Dendritiska celler är viktiga förmedlare av det adaptiva immunsvaret och den mest effektiva antigenpresenterande celler kännetecknas hittills. Metoder för människa och mus dendritiska cellodling i litteraturen skiljer sig i den typ av cytokiner som används för att påverka utvecklingen av olika dendritiska celltyper. Anmärkningsvärt är att GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa och IFN-gamma används i olika kombinationer för att producera mogna, omogna, inflammatoriska och steady-state som murin benmärg härrör dendritiska celler in vitro ^3-7. Här presenterar vi en enkel metod för produktion av mogna murina dendritiska celler som kan målsökande till dränerande lymfkörtlar efter subkutan injektion, presentera antigen och aktivering av NA har T-celler. Den resulterande dendritiska celler befolkningen är typiskt> 85% CD11chigh med inducerbara uttryck av CD80/86 på LPS aktivering. Tillägget av TNF- till kultur på dag 7 är frivilligt och ger en mer mogen phenotype8. Underhållet av in vitro Langerhans kulturer dendritiska celler, är TNF-alfa en viktig överlevnadsfaktor men inte stimulerar cellerna att mogna ^9. Det bör noteras att TNF-alfa från endogena källor (sannolikt stromaceller) har rapporterats att vara närvarande i kulturen medier ^7. Andra framgångsrika metoder för diagnostik subkutant injicerat dendritiska celler innehåller positiva val för CD11c + celler från mjälten samt samtidiga märkning och aktivering av endogena dendritiska celler ^{population1, 2, 10.} Produktion av CD11chigh dendritiska celler från benmärg är en robust metod som konsekvent producerar stora mängder dendritiska celler som kan antigen presentation in vivo viktigt i bildbehandling färd med adaptiva immunförsvaret aktiveras ^{11, 12.}