Summary
Antigen-Präsentation in sekundären lymphatischen Organen durch dendritische Zellen ist entscheidend für die Einleitung des T-Zell-vermittelten adaptive Immunantwort. Hier zeigen wir die Kultur von Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen, Aktivierung und Etikettierung für die 2-Photonen-Imaging.
Abstract
Mehrere Methoden für die Herstellung von murinen dendritischen Zellen sind in der Literatur gefunden werden. Hier präsentieren wir eine Methode, die größer als 85% CD11c hoch dendritischen Zellen produziert in Kultur, die Heimat der Lymphknoten nach subkutaner Injektion und präsentieren Antigen Antigen-spezifischen T-Zellen (siehe Video). Darüber hinaus verwenden wir Essen Instruments Incucyte zu dendritischen Zell-Reifung, wo am Tag 10, ist die Morphologie der kultivierten Zellen typisch für einen reifen dendritischen Zellen und <85% der Zellen sind CD11chigh verfolgen. Das Studium der Antigen-Präsentation in peripheren Lymphknoten durch 2-Photonen-Imaging ergab, dass es drei verschiedene Phasen der dendritischen Zellen und T-Zell-Interaktion 1, 2. Phase I besteht aus kurzen serielle Kontakte zwischen hoch bewegliche Antigen-spezifischen T-Zellen und Antigen tragen dendritische Zellen 1, 2. Phase zwei ist bei längerer Kontakte zwischen Antigen-spezifischen T-Zell-und Antigen-tragende dendritische Zellen 1, 2 markiert. Schließlich ist die Phase III von T-Zellen Ablösen von dendritischen Zellen, Wiedererlangung Motilität und Beginn auf 1, 2 teilen aus. Dies ist ein Beispiel für die Art von Antigen-spezifischen Wechselwirkungen, die durch Zwei-Photonen-Imaging von Antigen-beladenen Zellen tracker Farbstoff markierten dendritischen Zellen analysiert werden können.
Protocol
1) Entfernen Sie beide Oberschenkel Knochen von einer Maus
- Verwenden Sie Dissektion Schere wegschneiden Muskel-und aussetzen des Oberschenkelknochens oberhalb und unterhalb der Gelenke (Knie und Hüfte). Fassen Sie die Mitte des Oberschenkels mit Dissektion Pinzette und schneiden oberhalb und unterhalb der Gelenke, so viel von der Epiphyse intakt wie möglich zu verlassen.
- Reinigen Sie so viel Muskelmasse wie möglich mit kleinen Dissektion Schere. Übertragen Sie die Oberschenkel in eine Schüssel mit RPMI.
- Alle Verfahren sollten in der Motorhaube durchgeführt werden ab diesem Zeitpunkt mit nur sterile Medien, Instrumente, Pipettenspitzen und Kulturschalen.
2) sterilisieren Femur Knochen:
- In der Haube, Transfer Knochen aus dem RPMI zu einer kleinen Petrischale mit 70% Ethanol auf Eis gefüllt.
- Lassen Knochen in Ethanol für 5 Minuten auf Eis genießen.
3) Sammeln Knochenmark unter sterilen Bedingungen:
- Transfer-Knochen zu einer kleinen Petrischale mit sterilfiltriert Primary DC Kulturmedien.
- Mit einer sterilen Pinzette, halten Sie die Knochen über einen verwerfen Schale oder Rohr, und mit einer sterilen Schere, schneiden Sie jeden epiphesis (Enden der Knochen) aus. Der Schnitt sollte aussetzen Knochenmark, die leuchtend rot in der Mitte des Knochens.
- Mit einer sterilen Spritze (26-28 Gauge-Nadel), saugen ca. 100-200 ml sterile Medien.
- Halten Sie die Knochen mit den sterilen Pinzette über einen frischen Teller sterile Medien und die Nadel in die eine Seite des Knochens. Positionieren Sie die Spitze der Nadel in der Nähe der Spitze des Knochens und langsam waschen den Knochen mit dem sterilen Medien. Wenn Sie in der Mitte des Knochens sind, sollte die Nadel schieben in einfach.
- Das Knochenmark wäscht, entweder in kleinen Stücken oder als ein einziges Stück. Es sollte aus dem Knochen und in die Schüssel von sterilen Medien gespült werden.
- Wiederholen Sie diesen Schritt als notwendig, um vollständig zu waschen das Mark aus den Knochen.
- Wenn die Knochen sauber ist, wird es weiß und durchscheinend.
- Wiederholen Sie diesen Vorgang mit den anderen Oberschenkelknochens. Verwerfen jedes Oberschenkelknochens, wenn es sauber ist.
4) Re-suspend und Spin down Knochenmarkzellen:
- Transfer-Zellen in ein steriles Falcon-Röhrchen.
- Wenn Knochenmark noch intakt ist, sehr sanft Pipette Medien rauf und runter in die Schale aufzubrechen dem Knochenmark in einem einzigen Zellsuspension. Dies kann einige Minuten dauern und sollte langsam erfolgen, um zu vermeiden Abtötung von Zellen durch schiere Kraft.
- Centrifuge Zellen als jedes andere Säugetier-Zellen.
5) Cell Lysis:
- Entfernen Sie den Schlauch aus der Zentrifuge nach dem Spin ist getan und gießen Medien aus (dekantieren) in einen kleinen Abfall (50 ml Falcon-Röhrchen) in der Motorhaube.
- Pellet durch vorsichtiges Schnippen der Boden des Röhrchens.
- Mit sterilfiltriert Wasser und 10x DPBS oder 10x PBS, eine Wasseranalyse vornehmen Lyse der roten Blutkörperchen (Erythrozyten) mit den folgenden Bänden zu entfernen:
- 900 ml sterile gefilterte Wasser
- 100 mL 10x DPBS oder 10x PBS
- Add 100 ml 10x PBS 5-10 Sekunden nach der Zugabe des Wassers. Es ist sehr wichtig dies sofort, so dass nur die Erythrozyten lysiert sind. Es ist eine gute Idee, haben beide Pipetten gefüllt und fertig.
- Add 5 ml - 10 ml sterile DC basischen Medien.
6) Graf Cells:
- In der Haube, mischen Sie die 6 bis 11 ml Knochenmark-Zellen durch vorsichtiges Schwenken des Röhrchens mit einer leichten Inversion, eine 45-Grad-Neigung (nicht so, dass die Medien der Spitze der Röhre berührt)
- Nehmen Sie 10 ml Medium in einem sterilen Röhrchen zum Zählen.
- Re-cap die Zellen und Zentrifuge wieder.
7) Plating Dendritische Zellen:
- Die Zellen sind bei einer Dichte von 1 x 106/ml verchromt werden.
- Remove-Zellen aus der Zentrifuge, dekantieren Medien und resuspendieren Zellen in der entsprechenden Menge an Primary DC Medien für die Beschichtung.
- Legen Sie in Gewebekultur-Inkubator.
8) Kultur Pflege und Reifung:
Prüfen Sie stets Kulturen, bevor Sie mehr Medien oder den Einsatz in allen Experimenten. Überprüfen Sie die allgemeine Gesundheit der Zellen und nach möglichen Kontamination.
Tag 0: Dendritische Zellen ausplattiert.
TAG 3: Entfernen Sie 75% der Medien-und Nicht-adherant Zellen und wieder hinzuzufügen Primary DC Medien.
TAG 6: Nach dem ersten Zelle Plating: Re-Platte die Zellen mit dem folgenden Verfahren:
- Entfernen Sie das Medium, das einige nicht-adherant DCs an dieser Stelle, und in eine sterile 50 ml Falcon-Röhrchen enthalten, sollten Verlassen Platten sehr leicht feucht (Sie wollen nicht, dass die adhärenten Zellen austrocknen)
- Add 3 mM EDTA in PBS zu jeder Platte und lassen Sie sie 5 Minuten lang sitzen.
- Halten Sie die Platte in einem Winkel von 45 Grad und sanft Pipette Medien rauf und runter gegen die Unterseite der Platte vorsichtig lösen nicht adherant Zellen.
- EDTA / PBS sollte dicker Angabe Zellen werden vom Boden der gesammeltenPlatte.
- Nach einigen Minuten dieses kann Zellgemisch auf die 50 ml-Falcon-Röhrchen überführt werden.
- Spin allen Zellen nach der Durchführung dieses Verfahren für jede Platte.
- Graf und die Platte die Zellen bei einer Dichte von 1 x 10 ^ 6 pro Platte in Secondary DC Medien in neue sterile 10 cm Kulturschalen. Zurück Zellen Gewebekultur-Inkubator.
Tag 10-11
Reife DCs bereit zur Stimulation / Antigen-Beladung.
9) dendritische Zellen Stimulation:
- Verwenden LPS (lipopolyscaccharide) in Kombination mit gewünschten Peptids für die Aktivierung und Peptid-Beladung. Abhängig von Ihrer Quelle der LPS, können unterschiedliche Stimulation Bedingungen zu besseren Ergebnissen führen. Darüber hinaus sollten Sie die gewünschte Menge an Peptid für DC-Präsentation optimiert werden. Stimulation Bedingungen in diesem Protokoll wurden 100 ng / mL LPS und 100 ug / mL OVA (Ovalbumin).
- Laden Antigen / mit LPS für 18-24 Stunden vor der Ernte behandeln / zu verwenden.
Dendritische Zellen Media: Sterilfilter nach allem, was hinzugefügt wurde
Bitte beachten Sie die Diskussion Abschnitt für eine Überprüfung der verschiedenen dendritischen Zellkultur-Bedingungen und für die daraus resultierenden dendritischen Zell-Phänotyp. Diese Kultur Bedingungen sind so konzipiert, um zu reifen dendritischen Zellen produzieren, die rasch nach Hause, um Lymphknoten, 18-24 Stunden nach subkutaner Injektion und präsentieren Antigen effizient.
Primary DC Media: Sterilfilter nach allem, was hinzugefügt wurde
- 500 ml IMDM (entfernen 55-60 ml für 500 ml Endvolumen)
- 50 ml hitzeinaktiviertem FBS
- 5 ml 200 mM L-Gln, Endkonzentration von 2 mM
- 100 IU / mL Penicillin und 100 mg / ml Streptomycin (5 mL von 10.000 IU / mL Pen und 10.000 mg / mL Strep Lager)
- 50 uM B-Me (14,3 M B-Me Lager, verdünnte 1:100 in chemischen Kapuze, benutzen 35 ul pro 100 ml Medium für 50 mikromolaren Konzentration)
- 20-30 ng / mL GM-CSF
- 100-400 IU / mL IL-4 etwa 10 bis 40 ng / mL
SecondaryDC Medien für die Reifung *
100 ng / mL TNF-alpha (add to Primary DC Medien)
* Hinweis: GM-CSF + IL-4 sollten unreifen dendritischen Zellen zu produzieren. Mit GM-CSF + IL-4 (400 IU / ul) + TNF-alpha (100 ug / ml) erstellt Zellen, die reifen Monozyten abgeleiteten dendritischen Zellen ähneln. Reifen dendritischen Zellen sind bekanntermaßen nicht nehmen Antigen so effizient wie unreife dendritische Zellen und Kulturen endogenen TNF-a veröffentlicht von Stromazellen 4 haben kann.
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Discussion
Dendritische Zellen sind wichtige Mediatoren der adaptiven Immunantwort und die effizientesten Antigen-präsentierenden Zelle charakterisiert bis heute. Methoden für die Human-und Maus dendritischen Zellkultur in der Literatur in der Art der Zytokine verwendet werden, um die Entwicklung der verschiedenen dendritischen Zelltypen Einfluss abweichen. Bemerkenswert ist, dass GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alpha und IFN-gamma in verschiedenen Kombinationen eingesetzt, um zu reifen, unreifen, Entzündungs-und Steady-State-wie murine Knochenmark abgeleiteten dendritischen Zellen in vitro 3-7 produzieren. Hier präsentieren wir eine einfache Methode zur Herstellung von reifen dendritischen Zellen, die fähig sind Homing auf Lymphknoten nach subkutaner Injektion, präsentieren Antigen und Aktivierung na T-Zellen haben. Die daraus resultierenden dendritischen Zellpopulation ist in der Regel> 85% CD11chigh mit induzierbarer Expression von CD80/86 auf LPS-Aktivierung. Die Zugabe von TNF-, um die Kultur am Tag 7 ist optional und erzeugt eine reifere phenotype8. Die Aufrechterhaltung der in-vitro-Langerhans dendritischen Zellkulturen, ist TNF-alpha ein wichtiger Überlebensfaktor aber nicht stimulieren die Zellen bis 9 reifen. Anzumerken ist, dass TNF-alpha aus endogenen Quellen (wahrscheinlich Stromazellen) wurde berichtet, dass in den Kulturmedien 7 sein. Weitere erfolgreiche Methoden zur Darstellung von subkutan injizierten dendritischen Zellen gehören positive Selektion für CD11c + Zellen aus der Milz sowie gleichzeitige Kennzeichnung und die Aktivierung des endogenen dendritischen Zellen Bevölkerung1, 2, 10. Produktion von CD11chigh dendritischen Zellen aus dem Knochenmark ist eine robuste Methode, die konsequent produziert eine große Anzahl von dendritischen Zellen in der Lage Antigen-Präsentation in vivo, wichtig in der Bildgebung der Prozess der adaptiven Immunsystems Aktivierung 11, 12.
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Acknowledgments
National Institutes of Health Kirchstein Fellowship Promotionsstipendium AI-64128 (MPM), GM-41514 (MDC), GM-48071 (IP)
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