Summary
Dendritik hücreler tarafından ikincil lenfoid organlara Antijen sunumu T hücre aracılı adaptif immün yanıt başlatılması için çok önemlidir. Burada kemik iliği kültürü elde edilen fare dendritik hücreler, aktivasyon, 2-foton görüntüleme için etiketleme göstermektedir.
Abstract
Fare dendritik hücrelerin hazırlanması için çeşitli yöntemler literatürde bulunabilir. Burada, kültürde% 85 daha fazla CD11c yüksek dendritik hücreler üreten bir yöntem mevcut subkutan enjeksiyon ve antijen spesifik T hücreleri (video) mevcut antijen sonra drenaj lenf nodu ev. Ayrıca, 10 gün, kültürlü hücrelerinin morfolojisi, olgun bir dendritik hücre ve hücre <% 85 CD11chigh olan tipik, dendritik hücre olgunlaşması izlemek Essen Aletleri Incucyte kullanın. 2-foton görüntüleme ile periferik lenf düğümlerine antijen sunumu çalışma dendritik hücre ve T hücre etkileşimi 1, 2, üç farklı aşama olduğunu ortaya çıkardı. Faz I, son derece hareketli bir antijen spesifik T hücreleri ve dendritik hücreler 1, 2 taşıyan antijen arasında kısa seri kişilerin oluşur. Faz iki antijen spesifik T hücre ve dendritik hücreler 1, 2 yatak antijen arasındaki uzun süreli temas ile işaretlenir . Son olarak, Faz III, dendritik hücreler ayrılmakta motilite kazanmak ve 1, 2 bölmek için, T hücreleri tarafından karakterize edilir . Bu antijen yüklü hücre izci boya etiketli dendritik hücreler iki-foton görüntüleme ile analiz edilebilir antijen-spesifik etkileşimler türünün tek örneğidir.
Protocol
1) bir fare hem de femur kemikleri çıkarın
- Kas kesip ve femur kemik ve eklemlerde aşağıda (diz ve kalça) üzerinde açığa çıkarmak için diseksiyon makas kullanın. Diseksiyonu cımbız ile femur merkezi tutun ve mümkün olduğunca sağlam epifiz kadar terk etmek üstünde ve eklemlerde aşağıda kesmek.
- Küçük diseksiyon makas kullanılarak mümkün olduğu kadar çok kas olarak temizleyin. Femur RPMI bir tabak içine aktarın.
- Tüm işlemler, bu noktada sadece steril ortam, araçlar, pipet uçları ve kültür yemekleri kullanarak Kaputun yürütülen olmalıdır.
2) femur kemikleri sterilize:
- Kaput, buz üzerinde% 70 etanol ile dolu küçük bir kültür çanak RPMI kemik transferi.
- Kemikler için etanol içinde 5 dakika buz üzerinde emmek için izin verin.
3) Kemik iliği steril koşullar altında toplayın:
- Filtrelenmiş steril Temel DC kültür ortamı içeren küçük bir kültür çanak kemikleri aktarın.
- Steril bir pens ile kemik atmak çanak veya tüp üzerinde tutun ve steril makas ile (kemik uçları) her epiphesis kesti. Cut kemik merkezi parlak kırmızı kemik iliği göstermelidir.
- Steril bir şırınga ile (26-28 gauge iğne), 100-200 ml steril medya emmek.
- Tutun steril medya taze bir yemek üzerine steril bir pens ile kemik ve kemik bir tarafına iğne yerleştirin. Kemiğinin üst kısmına yakın bir iğne ucu yerleştirin ve yavaş yavaş steril ortam ile kemik yıkayın. Kemik merkezi iseniz, iğne kolayca slayt gerekir.
- Kemik iliği küçük parçalar halinde veya tek bir parça olarak, yıkar. Bu kemik ve steril medya çanak içine yıkanmalıdır.
- Kemik iliği tamamen yıkamak gerektiği gibi, bu adımı tekrarlayın.
- Kemik temiz, beyaz ve yarı saydam olacak.
- Diğer femur kemik ile bu yordamı yineleyin. Temiz bir kez her femur kemik atın.
4) yeniden askıya alma ve Kemik iliği hücreleri aşağı Spin:
- Hücreler steril bir şahin tüpüne aktarın.
- Iliği hala bozulmamış ise, çok nazik bir tek hücre süspansiyonu iliği break up, çanak ortamını pipet ve aşağı. Bu birkaç dakika sürebilir ve dik kuvvet tarafından hücreleri öldürerek önlemek için yavaş yavaş yapılmalıdır.
- Herhangi bir diğer memeli hücrelerinde olduğu gibi Santrifüj hücreleri.
5) Hücre Lizis:
- Spin yapıldıktan sonra santrifüj tüpünü çıkarın ve medya kapalı (süzün) kaput küçük bir atık (50 ml şahin tüp) içine dökün.
- Tüp yavaşça alt Flicking süspanse edin pelet.
- Steril filtre edilmiş su ve 10x DPBS veya 10x PBS kullanarak, aşağıdaki hacimler kullanarak kırmızı kan hücreleri (eritrositler) kaldırmak için bir su lizis yürütmek:
- 900 ml steril filtre edilmiş su
- 100 ml, 10x DPBS veya 10x PBS
- 10x PBS 5-10 saniye su ekledikten sonra 100 ml ekleyin. Sadece eritrositlerde parçalanmış olduğunu derhal Bunu yapmak çok önemlidir. Bu, hem pipetler hazır doldurulmuş ve iyi bir fikir.
- - 5 ml, 10 ml steril DC Temel ortam ekleyin.
6) Hücreler Sayısı:
- Kaputun, tüp nazikçe hafif bir inversiyon, 45 derecelik bir eğim (medya tüp üst dokunur böylece) ile dönen 6 ila 11 ml kemik iliği hücreleri karıştırmak
- Sayımı için steril bir tüp içine 10 ml medya çıkarın.
- Re-cap hücreleri ve santrifüj tekrar.
7) Kaplama Dendritik hücreler:
- Hücreler 1 x 106/mL yoğunluğu kaplı olmalıdır.
- İlköğretim DC Medya kaplama için uygun miktarda santrifüj hücreleri, süzün medya ve yeniden askıya alma hücreleri çıkarın.
- Doku kültürü inkübatör yerleştirin.
8) Kültür Bakım ve Olgunlaşma:
Her zaman daha fazla medya ekleyerek veya herhangi bir deney kullanarak önce kültürler kontrol edin. Hücre genel sağlık kontrol edin ve potansiyel kirlenme bakın.
GÜN: 0 Dendritik hücreler kaplama.
3. GÜN: medya ve olmayan adherant hücrelerin% 75 çıkartın ve geri İlköğretim DC medya ekleyebilirsiniz.
6. GÜN: İlk Hücre Kaplama sonra aşağıdaki yordamı kullanarak yeniden plaka hücreleri:
- (Yapışık hücrelere kurumasına istemiyorum) çok hafif ıslak tabak bırakarak, 50 ml steril bir şahin tüp olmayan bazı adherant DC'ler bu noktada, yeri ve içermelidir medya, Kaldır
- Her plaka için PBS içinde 3 mM EDTA ekleyin ve 5 dakika oturmak için izin verir.
- Plaka 45 derecelik bir açıyla tutun ve yavaşça olmayan adherant hücrelerin nazikçe çıkarmak için plakanın alt karşı medya pipet ve aşağı.
- EDTA / PBS kalın gösteren hücrelerin alt toplanan ediliyor olması gerektiğiniplakası.
- Bu birkaç dakika sonra, hücre karışımı 50 ml şahin tüpüne aktarılabilir.
- Her plaka için bu işlemi gerçekleştirdikten sonra tüm hücreleri Spin.
- Sayım ve plaka hücrelerin yoğunluğu 1 x 10 ^ 6 yeni steril 10 cm kültür kaplarına Orta DC Medya başına plaka. Hücreler doku kültürü inkübatör dönün.
GÜN 10-11
Olgun DC'ler stimülasyon / antijen yükleme için hazır.
9) Dendritik Hücre Uyarım:
- LPS (lipopolyscaccharide), aktivasyon ve peptid yükleme için istenen peptid ile birlikte kullanın. LPS kaynağına bağlı olarak, farklı stimülasyon koşulları daha iyi sonuçlar verebilir. Ayrıca, DC tanıtımı için peptid istenilen miktarda optimize edilmelidir. Bu protokol Uyarım koşulları 100 ng / ml LPS ve 100 ug / ml OVA (ovalbumin).
- Yük antijen / hasattan önce 18-24 saat LPS ile tedavi /.
Dendritik Hücre Medya: Steril filtre sonra her şeyi eklenmiştir
Farklı dendritik hücre kültürü koşullarında bir inceleme ve dendritik hücre fenotipi için tartışma bölümüne bakınız. Bu kültür koşulları olgun dendritik hücreler üretmek için tasarlanmış hızla subkutan enjeksiyon ve verimli bir şekilde mevcut antijen sonra 18-24 saat drene lenf düğümleri, ev.
İlköğretim DC Medya: Steril filtre sonra her şeyi eklenmiştir
- IMDM (500ml son hacmi 55-60 ml kaldırmak) 500 ml
- 50 ml ısı inaktive FBS
- 5 ml, 200 mM L-Gln, 2 mM nihai konsantrasyonu
- 100 IU / ml penisilin ve 100 mg / ml streptomisin (10.000 IU / mL Kalem ve 10.000 mg / ml Strep stok 5 ml)
- 50 UM B-Me (14.3 M B-Me stok, kimyasal kaput 1:100 sulandırmak, 50 mikromolar konsantrasyonu için 100 ml medya başına 35 ul kullanabilirsiniz)
- 20-30 ng / ml GM-CSF
- 100-400 IU / mL, IL-4, kabaca 10 - 40 ng / ml
Olgunlaşma * SecondaryDC medya
100 ng / ml, TNF-alpha (Birincil DC medya eklemek)
* Not: GM-CSF + IL-4 immatür dendritik hücreler üretmek gerekir. GM-CSF kullanımı + IL4 (400 IU / ul) + TNF-alpha (100 ug / ml), olgun monosit kökenli dendritik hücreler benzer hücreler yaratacaktır. Olgun dendritik hücrelerin immatür dendritik hücreler ve kültürler endojen TNF-a stromal hücreler yayımlanan 4 olabilir gibi verimli antijen almamaya bilinmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dendritik hücreler, adaptif immün yanıt, bugüne kadar karakterize en etkili antijen sunan hücre anahtar arabulucular. Literatürde insan ve fare dendritik hücre kültürü yöntemleri farklı dendritik hücre tiplerinin gelişimini etkilemek için kullanılan sitokinlerin türü farklıdır. Özellikle, GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa ve IFN-gama, olgun, olgunlaşmamış, inflamatuvar ve kararlı durum in vitro 3-7 dendritik hücreler elde edilen fare kemik iliği gibi üretmek için farklı kombinasyonları kullanılır . Burada, biz yeteneğine sahiptirler olgun fare dendritik hücrelerin üretimi için basit bir yöntem mevcut homing, subkutan enjeksiyondan sonra lenf düğümlerine drene antijen ve aktive T hücreleri ve na sunmak. Çıkan dendritik hücre popülasyonu genellikle LPS aktivasyon üzerine CD80/86 indüklenebilir ifade>% 85 CD11chigh. 7 gün kültür TNF- Ayrıca isteğe bağlı ve daha olgun bir phenotype8 üretir. In vitro Langerhans dendritik hücre kültürleri bakım, TNF-alpha önemli bir yaşam faktörüdür, ancak 9 olgun hücrelerin teşvik etmez . Endojen kaynaklardan TNF-alpha (büyük olasılıkla stromal hücreleri) kültür ortamı 7 bildirilmiştir dikkat edilmelidir. Için diğer başarılı görüntüleme yöntemleri subkutan enjekte dendritik hücreler dalak CD11c + hücreler için olumlu bir seçim yanı sıra eşzamanlı etiketleme ve endojen dendritik hücre aktivasyonu Nüfus1, 2, 10 içerir . CD11chigh dendritik hücreler kemik iliği üretimi sürekli görüntüleme adaptif immün sistem aktivasyonu 11, 12 sürecinde önemli bir in vivo antijen sunumu yeteneğine dendritik hücreler, çok sayıda üreten sağlam bir yöntemdir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
National Institutes of Health Kirchstein Bursu predoctoral dostluk AI-64.128 (MPM), GM-41.514 (MDC), GM-48.071 (IP)
References
- Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J Exp Med. 200, 847-856 (2004).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).
- Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102, 1753-1763 (2003).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. 3, (2001).
- Winzler, C., et al. Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med. 185, 317-328 (1997).
- Koch, F., et al. Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation. J Exp Med. 171, 159-171 (1990).
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Wei, S. H., et al. Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node. J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).
- Castellino, F., et al. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).
