Summary
次级淋巴器官树突状细胞的抗原呈现启动T细胞介导的适应性免疫反应的关键。在这里，我们展示了文化的骨髓衍生的小鼠树突状细胞，活化，双光子成像标签。
Abstract
编制小鼠树突状细胞的几种方法可以在文献中发现。在这里，我们提出了一种文化产生大于85％的表面CD11c树突状细胞的方法，回家后皮下注射和目前的抗原，抗原特异性T细胞（见视频）引流淋巴结。此外，我们使用埃森仪器Incucyte跟踪树突状细胞的成熟，其中，在第10天，培养细胞的形态是典型的一个成熟的树突状细胞和细胞<85％，是CD11chigh。抗原的外周淋巴结中的演示，通过双光子成像的研究发现，树突状细胞和T细胞相互作用1，2，有三个不同的阶段。第一阶段由高度能动的抗原特异性T细胞和抗原携带树突状细胞的1，2之间的简短的串行接触。第二阶段是标记抗原特异性T细胞和抗原轴承树突状细胞的1，2之间的长期接触。最后，第三阶段的特点是由树突状细胞的分离，恢复活力，并开始划分1，2的T细胞。这是抗原特异性的，可以通过加载抗原细胞跟踪染料标记的树突状细胞的双光子成像分析的交互类型的一个例子。
Protocol
1）从一个鼠标都股骨骨
- 使用夹层剪刀剪去肌肉和暴露的上方和下方的关节（膝关节和髋关节）的股骨。把握清扫镊子股骨中心和削减的上方和下方的关节离开尽可能完整的骨骺。
- 尽可能使用小夹层剪刀的肌肉清理干净。转移到一盘的RPMI股骨。
- 所有的程序应在油烟机，从这个角度上进行，使用无菌媒体，仪器，移液器和培养皿。
2）消毒股骨骨头：
- 在油烟机，转移骨骼的RPMI一个小培养皿中充满了70％冰乙醇。
- 允许骨骼中的乙醇浸泡5分钟就冰。
3）在无菌条件下收集的骨髓：
- 骨骼转移到一个小培养皿中含有无菌过滤的初级直流文化传媒。
- 用无菌镊子，缓缴丢弃的菜或管骨，并用无菌剪刀，切割每个epiphesis（完骨）关闭。切应揭露骨髓，这是鲜艳的红色在骨中心。
- 用无菌注射器（26-28号针头），吸了约100-200毫升的无菌媒体。
- 同在一个无菌媒体的新鲜菜的无菌镊子保持骨和骨的一端插入针。定位针骨上方附近的一角，慢慢地用无菌媒体骨。如果你是在骨的中心，针应该很容易滑动。
- 骨髓清洗，无论是在小件或单件。应该冲出骨和成菜无菌媒体。
- 重复这一步，需要完全洗骨的骨髓。
- 当骨是干净的，这将是白色和半透明的。
- 与其他股骨重复此过程。一旦它是干净的，倒掉每个股骨。
4）重新挂起和自旋向下骨髓细胞：
- 细胞转移到无菌的猎鹰管。
- 如果骨髓仍保存完好，非常轻柔吸管媒体和菜，分解成单细胞悬液的骨髓。这可能需要几分钟，应该慢慢来，以避免由纯粹的力量杀死细胞。
- 您将任何其他哺乳动物细胞的离心机细胞。
5）细胞裂解：
- 删除从离心管自旋完成后，倒入一个小废物（50毫升猎鹰管）在引擎盖媒体关闭（倒出）。
- 轻轻弹管底部的悬浮颗粒。
- 使用无菌过滤后的水和10倍DPBS或10X PBS，开展水溶解去除红血细胞（红细胞），使用以下几卷：
- 900毫升无菌过滤后的水
- 100毫升的10倍DPBS或10倍PBS
- 加入水后，加入100毫升10倍PBS 5-10秒。这是非常重要的，这样做立即使只有在红细胞裂解。这是一个好主意，有移液器都充满和准备。
- 加入5毫升 - 10毫升无菌直流基本媒体。
6）计数细胞：
- 在油烟机，6至11毫升的骨髓细胞混合，轻轻摇动管有轻微的反转，45度倾斜（不是让媒体接触抹胸）
- 成无菌计数管取出10毫升的媒体。
- 再盖再次细胞和离心机。
7）电镀树突状细胞：
- 应镀细胞在1 × 106/mL的密度。
- 取出适量的初级直流电镀媒体从离心机的细胞，倒出媒体和重新悬浮细胞。
- 在组织文化的孵化器的地方。
8）文化关怀和成熟：
请务必检查，然后再添加更多的媒体或在任何实验中使用的文化。检查一般健康的细胞，并寻找潜在的污染。
0天：树突状细胞的镀金。
第3天：75％的媒体和非adherant细胞取出，并添加回主直流媒体。
第6天：初始细胞后电镀：重制版的细胞，使用下列程序：
- 取出介质，它应该包含一些非adherant区议会在这一点上，并将其放置在无菌的50毫升猎鹰管，离开板极微湿（你不想贴壁细胞，干出）
- 3 mM EDTA的PBS中添加每块板，并允许坐5分钟。
- 保持在45度角的板轻轻吸管媒体和反对板轻轻驱逐非adherant细胞底部。
- EDTA / PBS应该成为较厚表明细胞正在收集从底部板。
- 本几分钟后，细胞的混合物，可转移至50毫升猎鹰管。
- 分拆后执行此过程为每个板块的所有细胞。
- 计数板在细胞密度为1 × 10 ^ 6每盘在新的无菌10厘米的培养皿中的直流媒体。返回细胞组织培养孵化器。
天10-11
准备好刺激/抗原负载的成熟DCs。
9）树突状细胞刺激：
- LPS（lipopolyscaccharide）结合使用所需肽激活和肽加载。根据你的LPS来源，不同的刺激条件下可能会更好的结果。此外，直流介绍肽所需的金额应进行优化。在本议定书的刺激条件分别为100 ng / mL的LPS和100微克/毫升的OVA（卵清蛋白）。
- 负载抗原与收获前18-24小时内毒素/治疗/使用。
树突状细胞介质：无菌过滤后一切已添加
请看到不同的树突状细胞的培养条件的审查和讨论导致的树突状细胞的表型部分。这些文化条件成熟树突状细胞，迅速18-24小时后，皮下注射和有效地提呈抗原，淋巴结。
初级直流媒体：无菌过滤后一切已添加
- IMDM（删除55-60毫升最终体积为500毫升500毫升）
- 50毫升热灭活胎牛血清
- 5毫升200毫米L -谷氨酰胺，终浓度为2毫米
- 100 IU / ml青霉素和100毫克/毫升链霉素（5毫升10,000 IU / mL的笔和10000毫克/毫升链球菌股票）
- 50 UM乙- ME（14.3 M B - ME股票，稀释化学罩1:100，使用50微摩尔浓度每100毫升媒体35 UL）
- 20-30毫微克/毫升GM - CSF的
- 100-400 IU / mL的IL - 4，大约10 - 40毫微克/毫升
SecondaryDC媒体成熟*
100 ng / mL的TNF -α（添加到初级直流媒体）
* 注 ：GM - CSF + IL - 4产生未成熟树突状细胞。使用GM - CSF + IL - 4（400 IU / UL）+ TNF -α（100微克/毫升），将创建类似成熟的单核细胞衍生的树突状细胞的细胞。成熟树突状细胞是已知的不占用抗原作为有效的未成熟树突状细胞和文化可能有内源性TNF - a的基质细胞释放4。
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Discussion
树突状细胞是关键介质的适应性免疫反应和最有效的抗原提呈细胞的特点。文献中对人类和小鼠树突状细胞培养的方法不同类型的细胞因子影响树突状细胞对不同类型的发展。值得注意的是，GM - CSF flt3L，IL4，IL13，TNF -α和IFN -γ是用来在不同的组合，产生成熟的，不成熟的，炎症和稳态像小鼠骨骨髓衍生树突状细胞在体外培养 3-7 。在这里，我们提出了一个简单的方法成熟的小鼠树突状细胞有能力生产归巢排水皮下注射后淋巴结肿大，提出NA已经抗原和激活T细胞。由此产生的树突状细胞的人口通常是脂多糖激活后诱导CD80/86表达CD11chigh> 85％。除了文化上的第7天TNF -是可选的，并且产生一个更加成熟的phenotype8。 体外朗格汉斯树突状细胞的培养维护，TNF -α是一种重要的生存因素，但不会刺激细胞成熟9。应该指出，从内源性来源的肿瘤坏死因子-α（可能是基质细胞）据报道，目前在文化媒体7。其他成像成功的方法皮下注射树突状细胞的CD11c +脾细胞的阳性选择以及并发标签和激活内源性树突状细胞的人口1，2， 10。 CD11chigh从骨髓的树突状细胞的生产是一个健壮的方法始终产生大量的树突状细胞抗原在体内的演示，在成像的适应性免疫系统的激活 ，11， 12的过程的重要。
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Acknowledgments
美国国立卫生Kirchstein奖学金predoctoral奖学金AI - 64128（MPM）的，GM - 41514（MDC）的GM - 48071（IP）
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