Generatie van beenmerg afgeleide Murine dendritische cellen voor gebruik in twee-foton Imaging

Summary

Antigeen presentatie in secundaire lymfoïde organen door de dendritische cellen is cruciaal voor de opening van het T-cel gemedieerde adaptieve immuunrespons. Hier laten we zien de cultuur van beenmerg afgeleide dendritische cellen van muizen, activering, en de etikettering voor 2-photon imaging.

Abstract

Verschillende methoden voor de bereiding van muizen dendritische cellen kan worden gevonden in de literatuur. Hier presenteren we een methode die meer dan 85% CD11c hoge dendritische cellen produceert in cultuur die de thuishaven van de drainerende lymfeklier na subcutane injectie en presenteren antigeen aan antigeen specifieke T-cellen (zie video). Daarnaast maken we gebruik van Essen Instruments Incucyte naar dendritische cel rijping, waar, op dag 10, de morfologie van de gekweekte cellen is typerend voor een rijpe dendritische cel en <85% van de cellen zijn CD11chigh track. De studie van antigeen presentatie in perifere lymfeklieren door twee-foton beeldvorming bleek dat er drie verschillende fasen van dendritische cel en T-cel interactie ^{1, 2.} Fase I bestaat uit korte seriële contacten tussen zeer beweeglijke antigeen specifieke T cellen en antigen dragen dendritische cellen ^{1, 2.} Fase twee wordt gekenmerkt door langdurige contacten tussen antigeen-specifieke T-cel en antigeen met dendritische cellen ^{1, 2.} Tot slot wordt fase III kenmerkt zich door T-cellen losmaken van dendritische cellen, het herwinnen van de beweeglijkheid en het begin tot het ^{1, 2} delen. Dit is een voorbeeld van het type van antigeen-specifieke interacties die kunnen worden geanalyseerd door twee-foton beeldvorming van antigeen-beladen cellen tracker dye-gelabelde dendritische cellen.

Protocol

1) Verwijder beide dijbeen botten van een muis

1. Gebruik dissectie schaar weg te snijden spieren en het dijbeen bot bloot boven en onder de gewrichten (knie en heup). Pak het midden van het dijbeen met de dissectie een pincet en snijd boven en onder de gewrichten om zoveel mogelijk van de epifyse als mogelijk intact laten.
2. Schoon uit zo veel spieren als mogelijk met behulp van kleine dissectie schaar. Overdracht het dijbeen in een schaal van RPMI.
3. Alle procedures moeten worden uitgevoerd in de motorkap vanaf dit punt, met alleen steriele media, instrumenten, pipetpunten en cultuur gerechten.

2) Steriliseer Femur botten:

1. In de kap, transfer botten van de RPMI tot een kleine cultuur schotel gevuld met 70% ethanol op ijs.
2. Laat botten om in ethanol weken voor 5 minuten op ijs.

3) Verzamel Beenmerg onder steriele omstandigheden:

1. Overdracht botten om een ​​kleine cultuur schotel met steriel gefiltreerd Primair DC cultuur media.
2. Met een steriele pincet, houdt het bot boven een gooi gerecht of buis, en met steriele schaar, snijd elke epiphesis (uiteinden van het bot) uit te schakelen. De cut moet blootstellen beenmerg, die is helder rood in het midden van het bot.
3. Met een steriele spuit (26-28 gauge naald), zuigen ongeveer 100-200 ml steriele media.
4. Houd het bot met de steriele pincet boven een verse schotel van steriele media en steek de naald in een kant van het bot. Plaats de punt van de naald buurt van de top van het bot en langzaam was het bot met de steriele media. Als u in het centrum van het bot, moet de naald glijden gemakkelijk in.
5. Het beenmerg wast uit, hetzij in kleine stukjes of als een enkel stuk. Het moet worden uitgespoeld van het bot en in de schaal van steriele media.
6. Herhaal deze stap als nodig is om volledig te wassen het merg uit het bot.
7. Wanneer het bot schoon is, zal het wit en doorschijnend.
8. Herhaal deze procedure met de andere dijbeen bot. Gooi elk dijbeen bot als het eenmaal schoon is.

4) Re-schorten en neer beenmergcellen Spin:

1. Overdracht cellen om een ​​steriele falcon buis.
2. Als beenmerg is nog intact, heel voorzichtig pipet media op en neer in de schaal, tot breken het merg in een enkele celsuspensie. Dit kan enkele minuten duren en moet langzaam worden gedaan om te voorkomen dat het doden van cellen door pure kracht.
3. Centrifuge cellen zoals u elke andere cellen van zoogdieren.

5) cellysis:

1. Haal de buis uit de centrifuge na de spin is klaar en giet media uit (giet) in een kleine afval (50 ml Falcon buis) in de motorkap.
2. Resuspendeer pellet door voorzichtig flicking de bodem van de buis.
3. Met behulp van steriel gefilterd water en 10x of 10x DPBS PBS, het uitvoeren van een water lysis aan de rode bloedcellen (RBC's) met behulp van de volgende hoeveelheden te verwijderen:
   • 900 ml steriel gefilterd water
   • 100 ml 10x DPBS of 10x PBS
4. Voeg 100 ml van 10x PBS 5-10 seconden na toevoeging van het water. Het is heel belangrijk doen dit meteen, zodat alleen de rode bloedcellen worden gelyseerd. Het is een goed idee om zowel pipetten gevuld en klaar.
5. Voeg 5 ml - 10 ml steriele DC basic media.

6) Aantal cellen:

1. In de kap, meng de 6 tot 11 ml van beenmergcellen onder voorzichtig schudden de buis met een lichte inversie, een 45 graden hoek (niet zo dat de media de bovenkant van de buis raakt)
2. Verwijder 10 ml van de media in een steriele buis voor het tellen.
3. Re-cap de cellen en centrifuge opnieuw.

7) Plating Dendritische cellen:

1. De cellen moeten worden uitgeplaat bij een dichtheid van 1 x 106/mL.
2. Verwijder de cellen van centrifuge, giet de media en resuspendeer cellen in de juiste hoeveelheid primaire DC-Media voor plating.
3. Plaats in weefselkweek incubator.

8) Cultuur Care en rijping:

Controleer altijd culturen voor het toevoegen van meer media of het gebruik in alle experimenten. Controleer de algemene gezondheid van de cellen en op zoek naar mogelijke verontreiniging.

DAG 0: Dendritische cellen uitgeplaat.

DAG 3: Verwijder 75% van de media en niet-adherant cellen en voeg terug Primair DC media.

Dag 6: Na de eerste Cell Plating: Re-bord van de cellen met behulp van de volgende procedure:

1. Verwijder de media, die sommige niet-adherant DC's op dit punt, en plaats dient te bevatten in een steriele 50 ml Falcon buis, waardoor platen zeer licht vochtig (u niet wilt dat de hechtende cellen uit te drogen)
2. Voeg 3 mM EDTA in PBS op elk bord en laat het zitten voor 5 minuten.
3. Houd de plaat in een hoek van 45 graden en zachtjes pipet media op en neer tegen de onderkant van de plaat voorzichtig los te maken van niet-adherant cellen.
4. EDTA / PBS zou moeten worden dikker aangeeft cellen worden verzameld van de bodem van deplaat.
5. Na enkele minuten van deze, kan celmengsel worden overgebracht naar de 50 ml Falcon buis.
6. Spin alle cellen na het uitvoeren van deze procedure voor elke plaat.
7. Tellen en het bord van de cellen bij een dichtheid van 1 x 10 ^ 6 per plaat op de middelbare DC Media in nieuwe steriele 10 cm cultuur gerechten. Keer terug cellen om weefselkweek incubator.

DAG 10-11

Ouder DC's gereed voor stimulatie / antigen laden.

9) Dendritische cel stimulatie:

1. Gebruik LPS (lipopolyscaccharide) in combinatie met de gewenste peptide voor activering en peptide laden. Afhankelijk van uw bron van LPS, kunnen verschillende stimulatie omstandigheden betere resultaten geven. Bovendien moet de gewenste hoeveelheid peptide voor DC-presentatie worden geoptimaliseerd. Stimulatie voorwaarden in dit protocol werden 100 ng / ml LPS en 100 ug / mL OVA (ovalbumine).
2. Belasting antigeen / behandelen met LPS voor 18-24 uur voor de oogst / gebruiken.

Dendritische Cell Media: Steriel filter nadat alles is toegevoegd

Zie de discussie sectie voor een overzicht van de verschillende dendritische cel kweekomstandigheden en voor de daaruit voortvloeiende dendritische cel fenotype. Deze cultuur voorwaarden zijn ontworpen om rijpe dendritische cellen te produceren die snel naar huis om drainerende lymfeklieren, 18-24 uur na subcutane injectie en presenteren antigeen efficiënt.

Primaire DC Media: Steriel filter nadat alles is toegevoegd

• 500 ml IMDM (verwijder 55-60 ml voor 500 ml eindvolume)
• 50 ml hitte geïnactiveerd FBS
• 5 ml 200 mM L-Gln, uiteindelijke concentratie van 2 mM
• 100 IE / ml penicilline en 100 mg / ml streptomycine (5 ml van 10.000 IU / ml Pen en 10.000 mg / ml Strep voorraad)
• 50 uM B-Me (14,3 M B-Me voorraad, 1:100 verdund in de chemische kap, gebruik van 35 ul per 100 ml media voor 50 micromolaire concentratie)
• 20-30 ng / ml GM-CSF
• 100 tot 400 IU / ml IL-4 ongeveer 10 tot 40 ng / mL

SecondaryDC media voor rijping *

100 ng / ml TNF-alfa (voeg toe aan primaire DC media)

* Opmerking: GM-CSF + IL-4 moet onvolgroeide dendritische cellen te produceren. Met behulp van GM-CSF + IL4 (400 IE / ul) + TNF-alfa (100 ug / ml) zal leiden tot cellen die lijken op volwassen monocyt afgeleid dendritische cellen. Rijpe dendritische cellen is bekend niet op te nemen antigeen zo efficiënt als onvolwassen dendritische cellen en culturen kunnen endogene TNF-a vrijgelaten uit stromale cellen ^4.

Discussion

Dendritische cellen zijn de belangrijkste bemiddelaars van de adaptieve immuunrespons en de meest efficiënte antigeen presenterende cel gekenmerkt to-date. Methoden voor mens en muis dendritische cel-cultuur in de literatuur verschillen in de aard van de cytokines gebruikt om de ontwikkeling van de verschillende soorten dendritische cel beïnvloeden. Met name zijn GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-alfa en IFN-gamma gebruikt in verschillende combinaties te produceren volwassen, onvolwassen, ontstekings-en steady-state, zoals muizen beenmerg afgeleide dendritische cellen in vitro ^3-7. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor de productie van volwassen muizen dendritische cellen die in staat zijn om homing drainerende lymfeklieren na subcutane injectie, de presentatie van antigeen en het activeren van T-cellen na ve. De resulterende dendritische cel populatie is meestal> 85% CD11chigh met induceerbare expressie van CD80/86 op LPS activering. De toevoeging van TNF- om de cultuur op dag 7 is optioneel en produceert een meer volwassen phenotype8. Het onderhoud van de in vitro Langerhans dendritische cel culturen, TNF-alfa is een belangrijk factor te overleven, maar niet het stimuleren van de cellen ⁹ rijpen. Opgemerkt moet worden dat de TNF-alfa uit endogene bronnen (waarschijnlijk stromale cellen) is gemeld aanwezig te zijn in de cultuur media ^7. Andere succesvolle methoden voor het afbeelden van subcutaan geïnjecteerd dendritische cellen omvatten positieve selectie voor CD11c + cellen van de milt als gelijktijdige etikettering en activering van de endogene dendritische cel ^{population1, 2, 10.} Productie van CD11chigh dendritische cellen uit beenmerg is een robuuste methode die consistent produceert grote aantallen van dendritische cellen die in staat van antigeen presentatie in vivo, belangrijk in de beeldvorming het proces van het adaptieve immuunsysteem activering van ^{11, 12.}