Summary
Антиген презентации во вторичных лимфоидных органах по дендритных клеток имеет решающее значение для инициирования Т-клеток опосредованный адаптивный иммунный ответ. Здесь мы показываем, культуре костного мозга производных мышиных дендритных клеток, активации, и маркировки для 2-фотонного изображения.
Abstract
Существует несколько методов для подготовки мышиных дендритных клеток можно найти в литературе. Здесь мы представляем метод, который производит более 85% CD11c высокой дендритных клеток в культуре, дома дренаж лимфатических узлов после подкожного введения и настоящего антигена антиген специфический Т-клеток (см. видео). Кроме того, мы используем инструменты Эссен Incucyte отслеживать созревание дендритных камеру, где, в день 10, морфология культивируемых клеток характерна для зрелых дендритных клеток и <85% клеток CD11chigh. Изучение презентации антигена в периферических лимфатических узлов на 2-фотонных изображений показал, что Существуют три различных этапа дендритных клеток и Т-клеточного взаимодействия 1, 2. Этап I состоит из краткого серийный контактов между высоко подвижных антиген специфический Т-клеток и антигена проведения дендритные клетки 1, 2. Второй этап характеризуется длительным контактам между антиген-специфических Т-клеток и антигена подшипников дендритные клетки 1, 2. Наконец, фаза III характеризуется Т-клеток, отходящие от дендритных клеток, восстановление подвижности и начинают делить 1, 2. Это один из примеров типа антиген-специфические взаимодействия, которые могут быть проанализированы двухфотонного изображения антиген-загружалась ячейки трекер красителя меченных дендритные клетки.
Protocol
1) Снимите оба бедра кости от одной мыши
- Используйте рассечение ножницами, чтобы отрезать мышц и подвергать бедренной кости выше и ниже суставов (коленных и тазобедренных). Возьмитесь центр бедренной кости с рассечением пинцет и голову выше и ниже суставов уйти, так как большая часть эпифиза нетронутыми, насколько возможно.
- Очистите сила мышц, возможна с помощью небольших ножниц рассечение. Передача бедра в блюдо RPMI.
- Все процедуры должны выполняться в капюшоне с этого момента, используя только стерильные среды, инструменты, наконечники и культуры блюд.
2) Стерилизовать бедра кости:
- В капот, передача костей RPMI в небольшое блюдо культуры заполнены на 70% этанола на льду.
- Разрешить кости, чтобы впитать в этаноле в течение 5 минут на льду.
3) Сбор костного мозга в стерильных условиях:
- Передача кости небольшое блюдо культуры, содержащие стерильно фильтруют Первичная культура DC СМИ.
- С стерильный пинцет, удерживая кость над блюдом отказать или трубки, и стерильными ножницами, разрезать каждый epiphesis (концы кости) выключен. Сократить должны подвергать костного мозга которая ярко-красным в центре кости.
- С стерильный шприц (26-28 иглы), сосать около 100-200 мл стерильного средства массовой информации.
- Держите кости с стерильный пинцет более свежие блюда из стерильных средств массовой информации и вставить иглу в одну сторону кости. Поместите кончик иглы в верхней части кости и медленно мыть кости с стерильных средств массовой информации. Если вы находитесь в центре кости, игла должна слайд легко.
- Костного мозга вымывает, либо в мелкие кусочки или как единое целое. Следует вспыхнул из кости и в блюдо стерильных средств массовой информации.
- Повторите этот шаг, по мере необходимости, чтобы полностью вымыть мозг из костей.
- Когда кости чист, то он будет белым и прозрачным.
- Повторите эту процедуру с другой кости бедра. Отменить каждого бедренной кости, когда он будет чистым.
4) Снова приостановить и спин вниз клетки костного мозга:
- Передача клетки стерильную пробирку сокола.
- Если мозг не тронута, очень осторожно пипеткой средств массовой информации вверх и вниз в тарелку, чтобы разбить мозга в суспензии отдельных клеток. Это может занять несколько минут и следует проводить медленно, чтобы избежать убийства клетки одной только силой.
- Центрифуга клетки, как и любой другой клетки млекопитающих.
5) лизиса клеток:
- Снимите трубку из центрифуги после спина делается и залить СМИ выключен (перелить) в небольших отходов (50 мл сокола трубки) в капюшоне.
- Ресуспендируют гранул, аккуратно стряхивая нижней части трубы.
- Использование стерильной фильтрованной воды и 10x или 10x DPBS PBS, осуществляют лизис воды для удаления красных кровяных телец (эритроцитов) с использованием следующих объемах:
- 900 мл стерильной фильтрованной воды
- 100 мл 10х или 10х DPBS PBS
- Добавить 100 мл 10х PBS 5-10 секунд после добавления воды. Очень важно сделать это немедленно, так что только эритроциты лизируются. Это хорошая идея, чтобы иметь как пипетки заполнены и готовы.
- Добавьте 5 мл - 10 мл стерильного DC СМИ основной.
6) Считайте Клетки:
- В капот, смешать с 6 по 11 мл клеток костного мозга, осторожно вращая трубку с небольшой инверсии, 45 наклона степени (не так, чтобы средства массовой информации касается верхней части трубки)
- Удалить 10 мл СМИ в стерильную пробирку для подсчета.
- Re капитализации клеток и центрифуга снова.
7) клетки Дендритные Покрытие:
- Клетки должны быть покрыты при плотности 1 х 106/mL.
- Удалить клетки из центрифуги, переливать СМИ и вновь приостановить клеток в соответствующее количество первичных СМИ постоянного тока для металлизации.
- Место в культуре ткани инкубатора.
8) Уход культуры и созревание:
Всегда проверяйте культур, прежде чем добавлять больше средств массовой информации или использования в каких-либо экспериментов. Проверьте общее состояние здоровья клеток и искать потенциальных загрязнений.
ДЕНЬ 0: дендритные клетки покрытием.
ДЕНЬ 3: Удаление 75% от средств массовой информации и неправительственные adherant клеток и добавить обратно Первичная DC СМИ.
День 6: После Первоначальное покрытие Cell: Re пластины клетки, используя следующую процедуру:
- Удалить средства массовой информации, которое должно содержать некоторые не adherant контроллеры домена в этой точке, и место в стерильные 50 мл трубки сокол, в результате чего пластины слегка влажной (вы не хотите, прилипшие клетки высохнуть)
- Добавьте 3 мМ ЭДТА в PBS в каждую тарелку и позволить сидеть в течение 5 минут.
- Держите пластины на 45 градусов и осторожно пипеткой средств массовой информации вверх и вниз от нижней части пластины, чтобы аккуратно выбить без adherant клеток.
- ЭДТА / PBS должна стать толще указывает клетки собирают со днапластины.
- После нескольких минут этого, сотовые смеси могут быть перенесены на 50 мл трубки сокола.
- Спиновые всех клеток после выполнения этой процедуры для каждой пластины.
- Граф и пластины клеток при плотности 1 х 10 ^ 6 на чашку в средней СМИ DC в новом стерильном 10 блюд см культуры. Вернуться клетки культуры ткани инкубатора.
ДЕНЬ 10-11
Зрелые РС готовы к стимуляции / антиген нагрузки.
9) Дендритные Стимуляция Cell:
- Использование ЛПС (lipopolyscaccharide) в сочетании с желаемым пептид для активации и пептид нагрузки. В зависимости от исходного ЛПС, различные условия стимуляция может дать лучшие результаты. Кроме того, необходимое количество пептида для представления постоянного тока должны быть оптимизированы. Стимуляция условия в этом протоколе были 100 нг / мл LPS и 100 мкг / мл OVA (яичный альбумин).
- Нагрузка антиген / отнестись с ЛПС в течение 18-24 часов до сбора урожая / использования.
Дендритные СМИ Cell: стерильный фильтр после всего, была добавлена
Пожалуйста, см. обсуждение в разделе обзор различных дендритных условиях культуры клеток и в результате клетка фенотип дендритных. Эти условия культивирования предназначены для получения зрелых дендритных клеток, которые быстро домой слива лимфатических узлов, 18-24 часов после подкожного введения и представить антиген эффективно.
Первичная DC СМИ: Стерильный фильтр после всего, была добавлена
- 500 мл IMDM (удалить 55-60 мл для конечного объема 500 мл)
- 50 мл инактивированной тепла FBS
- 5 мл 200 мМ L-Gln, конечной концентрации 2 мМ
- 100 МЕ / мл пенициллина и 100 мг / мл стрептомицина (5 мл 10 000 МЕ / мл Пена и 10000 мг / мл Strep акций)
- 50 мкМ B-Me (14,3 M B-Me акции, развести 1:100 в капот химической, использовать 35 ул на 100 мл средств массовой информации в течение 50 мкмоль концентрации)
- 20-30 нг / мл GM-CSF
- 100-400 МЕ / мл IL-4 примерно на 10 - 40 нг / мл
SecondaryDC средств массовой информации для созревания *
100 нг / мл, ФНО-альфа (добавить в первичной DC СМИ)
* Примечание: GM-CSF + IL-4 должна производить незрелые дендритные клетки. Использование GM-CSF + IL4 (400 МЕ / ул) + ФНО-альфа (100 мкг / мл) будет создавать клетки, которые напоминают зрелых моноцитов дендритных клеток. Зрелые дендритные клетки, как известно, не занимать антиген так же эффективно, как незрелые дендритные клетки и культур может иметь эндогенное TNF-освободили из стромальных клеток 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Дендритные клетки являются ключевыми медиаторами адаптивного иммунного ответа и наиболее эффективным антигенпрезентирующие клетка характеризуется на сегодняшний день. Методы человека и мыши дендритных клеток культуры в литературе различаются по типу цитокинов использовать для влияния на развитие различных дендритных типов клеток. В частности, GM-CSF, flt3L, IL4, IL13, TNF-альфа и гамма-интерферона используются в различных комбинациях для получения зрелых, незрелые, воспалительных и стационарные, как мышиный костного мозга дендритных клеток в пробирке 3-7. Здесь мы приводим простой способ получения зрелых мышиных дендритных клеток, которые способны самонаведения для слива лимфатических узлов после подкожной инъекции, представляя антигена и активации наивны Т-клеток. В результате население дендритных клеток, как правило,> 85% CD11chigh с индуцибельной экспрессии CD80/86 после активации ЛПС. Кроме того ФНО- к культуре на 7 день не является обязательным и производит более зрелым phenotype8. Поддержание в пробирке Лангерганса культур дендритные клетки, TNF-альфа является важным фактором выживания, но не стимулирует клетки зрелой 9. Следует отметить, что TNF-альфа из эндогенных источников (вероятно, стромальные клетки), как сообщается, присутствовать в культуре средств массовой информации 7. Другие успешные методы для работы с изображениями подкожно вводили дендритные клетки включают положительный отбор на CD11c + клеток из селезенки, а также одновременной маркировки и активация эндогенной ячейки дендритных population1, 2, 10. Производство CD11chigh дендритных клеток из костного мозга является надежным методом, который последовательно производит большое количество дендритных клеток, способных к презентации антигена в естественных условиях, важно в визуализации процесса адаптивной активации иммунной системы 11, 12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Национальные институты здоровья Kirchstein стипендий predoctoral общение АИ-64 128 (MPM), GM-41514 (MDC), GM-48071 (IP)
References
- Miller, M. J., Safrina, O., Parker, I., Cahalan, M. D. Imaging the single cell dynamics of CD4+ T cell activation by dendritic cells in lymph nodes. J Exp Med. 200, 847-856 (2004).
- Henrickson, S. E., et al. T cell sensing of antigen dose governs interactive behavior with dendritic cells and sets a threshold for T cell activation. Nat Immunol. 9, 282-291 (2008).
- Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102, 1753-1763 (2003).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Lutz, M. B., et al. Differential functions of IL-4 receptor types I and II for dendritic cell maturation and IL-12 production and their dependency on GM-CSF. J Immunol. 169, 3574-3580 (2002).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Inaba, K., Swiggard, W. J., Steinman, R. M., Romani, N., Schuler, G. Isolation of dendritic cells. Curr Protoc Immunol. 3, (2001).
- Winzler, C., et al. Maturation stages of mouse dendritic cells in growth factor-dependent long-term cultures. J Exp Med. 185, 317-328 (1997).
- Koch, F., et al. Tumor necrosis factor alpha maintains the viability of murine epidermal Langerhans cells in culture, but in contrast to granulocyte/macrophage colony-stimulating factor, without inducing their functional maturation. J Exp Med. 171, 159-171 (1990).
- Miller, M. J., Hejazi, A. S., Wei, S. H., Cahalan, M. D., Parker, I. T cell repertoire scanning is promoted by dynamic dendritic cell behavior and random T cell motility in the lymph node. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 998-1003 (2004).
- Wei, S. H., et al. Ca2+ signals in CD4+ T cells during early contacts with antigen-bearing dendritic cells in lymph node. J Immunol. 179, 1586-1594 (2007).
- Castellino, F., et al. Chemokines enhance immunity by guiding naive CD8+ T cells to sites of CD4+ T cell-dendritic cell interaction. Nature. 440, 890-895 (2006).