Summary
التفريق بين ESC يتزامن مع خلية من نوع تغييرات معينة في بنية وتركيبة لونين. الكشف عن هذه التغييرات يقدم أفكارا قيمة حول الآليات التي تحدد stemcellness وتمايز الخلايا. مناعي لونين (CHIP) يمثل قيمة لأسلوب تشريح الآليات الجزيئية الكامنة وراء تمايز الخلايا الجذعية.
Abstract
تعقد الوظيفية والهيكلية لعدد لا يحصى من الخلايا في الكائنات metazoan ينشأ من عدد قليل من الخلايا الجذعية. وتتميز الخلايا الجذعية من قبل اثنين من الخصائص الأساسية : تقرير المصير ، وتجديد multipotency تسمح الخلايا الجذعية على التمايز إلى أي نوع تقريبا الخلية 1. وتتميز الخلايا الجذعية إلى خلية تقدم متباينة من فقدان التغيرات multipotency والهيكلية والبنيوية والنشاط هرمية من عوامل النسخ والجزيئات الإشارة ، أنشطتها إنشاء وصيانة الخلية من نوع معين أنماط التعبير الجيني. على المستوى الجزيئي ، وتمايز الخلايا ينطوي على تغييرات ديناميكية من هيكل وتشكيل لونين والكشف عن تلك التغيرات الدينامية يمكن أن توفر معلومات قيمة حول الميزات الفنية للخلايا الجذعية وعملية تمايز الخلايا 2،3. الكروماتين هو ضغط عالية الحمض النووي والبروتينات المعقدة التي تشكل خلايا الحمض النووي عندما حزمة الكروموسومات مع البروتينات ، histones أساسا 4. ارتبط Stemcellness وتمايز الخلايا مع وجود صفائف معينة من البروتينات التنظيمية مثل عوامل جينية ، هيستون متغيرات وعوامل النسخ 2،3،5.
الكروماتين مناعي (رقاقة) يوفر طريقة قيمة لرصد وجود الحمض النووي الريبي ، والبروتينات ، والتعديلات البروتين في لونين 6،7. ويمكن المقارنة بين لونين من أنواع مختلفة من الخلايا توضيح التغيرات الدينامية في البروتين لونين الجمعيات التي تحدث أثناء تمايز الخلايا.
مناعي لونين ينطوي على تنقية في لونين عبر ربط الجسم الحي. يتم تقليل ونين معزولة لشظايا أصغر بواسطة الهضم الأنزيمي أو القوة الميكانيكية. وعجلت به لونين شظايا الأجسام المضادة المحددة لاستهداف البروتينات أو البروتينات والحمض النووي التعديلات. تتم تنقيته من الحمض النووي الريبي أو عجل واستخدامها كنموذج لفحوصات الحمض النووي أو PCR ميكروأري القائمة. الشروط الأساسية لنجاح الشذرة هي اجسام مضادة ذات جودة عالية للمستضد المطلوب وتوافر لونين من خلايا السيطرة التي لا تعبر عن الجزيء المستهدف. ويمكن ربط الشذرة وجود البروتينات ، والبروتينات والحمض النووي الريبي التعديلات ، والحمض النووي الريبي DNA مع هدف محدد ، واعتمادا على اختيار أداة outread ، بالكشف عن ارتباط الجزيئات المستهدفة في الجينات أو هدف محدد في سياق الجينوم بأكمله. ويمكن مقارنة لتوزيع البروتينات في الخلايا لونين التفريق توضيح التغيرات الديناميكية لتكوين لونين التي تتزامن مع تطور الخلايا على طول نسب الخلية.
Protocol
خلايا ES الذوبان (غير المعروضة في الفيديو)
يتم تجميد الخلايا التي تحتوي على وفاق في المتوسط DMSO 10 ٪. منذ DMSO يمكن أن تحفز التفريق بين الخلايا وفاق ، ويمكن ان يكون من الممكن لذوبان الجليد الخلايا في وقت متأخر من اليوم وحتى لتغيير المتوسطة في صباح اليوم التالي للتقليل من آثار DMSO المتبقية.
- معطف زراعة الأنسجة 6 - جيدا لوحة مع الجيلاتين 0.1 ٪ على الأقل 15 دقيقة ، ونضح على الفور من قبل لوحة على الخلايا.
- خلايا ES ذوبان الجليد (حوالي 5 × 10 6 خلايا ، أي ما يعادل 6 متموجة أيضا) في 37 درجة مئوية وحمام المياه المخففة في 10 مل من prewarmed ES المتوسطة الخلية.
- بيليه الخلايا من خلال الدوران لمدة 10 دقيقة في 1000 دورة في الدقيقة في جهاز للطرد المركزي المقعد العلوي السريرية.
- نضح قبالة المتوسطة والخلايا resuspend برفق في 10 مل من 37 درجة مئوية prewarmed المتوسطة.
- نقل الخلية إلى تعليق لوحة 6 - جيدا وينمو بمعدل 37 درجة مئوية في ترطيب 5 ٪ CO 2 الحاضنة.
- تغيير المتوسطة في اليوم التالي لإزالة الخلايا الميتة وDMSO المتبقية.
المرور والتوسع في زراعة الخلايا ES
وpassaged بشكل روتيني كل خلايا ES 2 / 3 أيام ، ويتم تغيير المتوسطة يوما بعد يوم. وبالتالي ، فإن خلايا ES تتطلب اهتماما يوميا. في تجربتنا ، التغذية المستقلة الخلايا تنمو بسرعة وفاق ويحمض بسرعة متوسطة ، ويحولها الصفراء. وسوف تسمح للخلايا ليحمض المتوسطة (التي لا تتغير كل يوم وسائل الإعلام أو من خلال الركض الخلايا في تخفيف مستوى منخفض جدا) يسبب أزمة للخضوع الخلايا ، مما اثار تمايز الزائدة وموت الخلايا ، وبعد ذلك لا يمكن لها أن تضمن شمول الوسع. ويمكن طلاء الخلايا في كثافة منخفضة جدا ، والتشتت كافية من الخلايا أثناء مرورها ، أو طلاء متفاوتة يسبب مشاكل مشابهة ، وسوف تشكل الخلايا كتل كبيرة قبل الوصول إلى نقطة التقاء والخلايا داخل هذه التكتلات سيكون التفريق أو الموت. Germline انتقال هو انخفاض كبير في الخلايا التي تم سوء المعاملة ، حتى عندما تبدو صحية في وقت الحقن.
- لوحة 6 - جيدا متموجة من الخلايا نضح المتوسط قبالة وتغسل مع 2-3 مل من 37 درجة مئوية prewarmed PBS ، pipetting بعيدا من الخلايا.
- تغطية الخلايا مع 1 مل من 1 × التربسين حل لمدة 3-4 دقائق أو حتى تنتشر بشكل موحد الخلايا في كتل صغيرة.
- إضافة 1 مل من المتوسط لإبطال نشاط التربسين.
- جمع الخلايا والخلايا trypsinized لوحة (عادة 2 / 5 أيضا) لوحة 6 - جيدا gelatinized حديثا.
تجميد الخلايا ES
- يعرض للتريبسين a - 6 متموجة كذلك لوحة (حوالي 1 × 10 7 الخلايا) كما هو موضح أعلاه.
- جمع الخلايا trypsinized في 9 مل من المتوسط وبيليه لمدة 5 دقائق في 1000 دورة في الدقيقة.
- نضح قبالة المتوسطة وresuspend بيليه خلية في 1 مل من المتوسط تجميد الطازجة. قسامة 0.5 مل من الخلايا إلى قسمين cryotubes.
- تجميد قارورة في -80 درجة مئوية خلال الليل ونقل إلى النيتروجين السائل لمدة طويلة الأجل للتخزين.
الشذرة على رقاقة PROCEDURE
مناعي
- خلايا يشابك الفورمالديهايد (للخلايا تعليق)
- استخدام 5 × 07 حتي 01 أكتوبر × 10 8 خلايا لكل مناعي.
- إضافة جديدة للفورمالدهايد تعليق الخلية بتركيز 1 ٪.
- Incubates الخلايا مع محلول الفورمالديهايد لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إضافة حجم 1 / 10 من جليكاين 1.25 م لإرواء فورمالديهايد.
- شطف الخلايا مرتين مع 10 مل من 1X PBS.
- تجمع الخلايا في أنابيب مخروطية 50 مل وتدور في 700g لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. تجاهل وطاف بيليه resuspend في 1.5 مل من الاحتياطي تحلل. نقل الخلايا في أنبوب 1.5 مل microfuge.
- فلاش تجميد الخلايا ثلاث مرات في النيتروجين السائل واستخدام طاحونة الأنسجة لكسر الخلايا. بمجرد crosslinked الخلايا ، قد يكون تخزينها في المجمد -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
إعداد حبات المغناطيسي (يتم تنفيذ كافة الخطوات في 4 درجات مئوية)
- إضافة 50 ميكروليتر من الخرز Dynal إلى 1.5 مل microtube الاحتفاظ منخفضة. انشاء أنبوب 1 من الخرز في مناعي. إضافة 1 مل محلول بلوك.
- جمع حبات باستخدام Dynal MPC. أنابيب في مكان الرف المغناطيسي. السماح لجمع حبات على جانب الأنبوب. هذا يجب أن تأخذ حوالي 15 ثانية. عكس رف مرتين للمساعدة في جمع الخرز. إزالة طاف مع pipettor.
- إضافة 1 مل من محلول بلوك والخرز resuspend برفق في إزالة الشريط المغناطيسي من رف رف وعكس ، مع الأنابيب لا تزال في المكان -- إما 1-20 مرات ، أو حتى resuspend بالتساوي الخرز. جمع حبات على النحو الوارد أعلاه (الخطوة 2). إزالة طاف مع pipettor.
- تغسل حبات في 1.5 مل محلول بلوك ، كما في الخطوة 3 ، واحد مزيد من الوقت.
- Resuspend الخرز في 750 ميكرولتر كتلة الحل وإضافة 10 ميكروغرام من الأجسام المضادة. في احتضان 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 6H ، أو بين عشية وضحاها ، على محور دوار.
- تغسل حبات three رIMES في بلوك 1 مل الحل ، كما هو موضح في الخطوة 3.
خلية صوتنة
- إزالة الكريات الخلايا المجمدة من الخلايا -80 C ° إلى نقل وأنابيب لصوتنة. نحن نفضل في الوقت الراهن لاستخدام الجزء السفلي من polupropylene القياسية ، 15 مل أنبوب مخروطي صوتنة. نحن خفض الأنبوب في اثنين قطع على علامة 5 مل وتجاهل النصف العلوي. يمكن تغطيتها مع parafilm أنابيب أو مع غطاء الأنبوب أثناء إعداد.
- باستخدام أنبوب رف microfuge ، أنبوب الموقف حتى لجنة التحقيق sonicator يجلس حوالي 0،5-1،0 سم فوق الجزء السفلي من الأنبوب. الحرص على أن يتركز التحقيق وعدم الاتصال على جانبي الأنبوب. (يمكن أن تؤثر على المواقع دقق ما إذا كان حل الرغاوي أم لا خلال صوتنة. نموذجيا ، رغوة يشير إلى أنه سيتم الحمض النووي sonicated المنفصمة سيئة.)
- يصوتن تعليق 6 مرات خلال 20 ثانية. يجب أن تبقى في حمام عينات الجليد المياه خلال صوتنة. لخفض الرغوة ، حددت في البداية لانتاج الطاقة وزيادة 0 يدويا إلى السلطة النهائية خلال اول انفجار. (إذا كان هناك رغوة كبيرة ، يمكن إزالة جميع فقاعات بواسطة الطرد المركزي في 20000 ز تليها إعادة تعليق لطيف لجميع المواد ، دون ترك أي فقاعات الرغوة).
- تدور ز 20000 لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية لتكوير الحطام وحصاد طاف في أنبوب مل 1.5.
- انقاذ 50 lysate ميكرولتر من كل خلية من عينة ال DNA المدخلات. المحل في -20 درجة مئوية. يجب أن تبقى واحدة على الأقل في إدخال الحمض النووي قسامة دفعة من lysate يصوتن. علما بأنه لا يمكن للآثار آثار صوتنة وتوزيع جزء من أحجام الناتجة يتم التحقق بعد انقلاب تشعبي وتنقيتها من الحمض النووي.
مناعي لونين
- إضافة مبلغ الكروماتين يعادل 5 × 07-01 أكتوبر × 10 8 خلايا من صوتنة الخلية ، الخطوة 4 إلى مزيج الأجسام المضادة 50 / مغناطيسية ميكرولتر حبة من الخرز إعداد المغناطيسي ، والخطوة 6 مع الحجم النهائي من 1 مل (ويمكن أن يكون من الممكن ضبط مخزن مع تحلل ، إذا من أي وقت مضى). بين عشية وضحاها على احتضان المدورة في 4 درجات مئوية.
غسل
- جمع حبات باستخدام Dynal MPC. أنابيب في مكان الرف. السماح لجمع حبات على جانب الأنبوب. ينبغي أن يكون هذا يستغرق حوالي 20 ثانية. عكس رف مرتين للمساعدة في جمع كل الخرز. إزالة طاف مع pipettor ، وتغيير نصائح بين العينات.
- إضافة 1 مل الاحتياطي تحلل كل أنبوب والخرز resuspend بلطف. يمكن القيام بذلك عن طريق إزالة الشريط المغناطيسي من رف رف وعكس ، مع الأنابيب لا تزال في مكانها -- 1-20 مرات أو معلق حتى يتم بالتساوي الخرز. جمع الخرز. إزالة طاف بواسطة pipettor. كرر هذا يغسل 5 مرات أكثر ، وتغيير نصائح بين يغسل.
- تغسل حبات 6 مرات في 1 مل IP1 الاحتياطي ، كما هو موضح في الخطوة 2.
- تغسل حبات 6 مرات في 1 مل IP2 الاحتياطي ، كما هو موضح في الخطوة 2.
- تغسل حبات 6 مرات في 1 مل 8.0 TE الاحتياطي ، كما هو موضح في الخطوة 2.
- تدور 960g لمدة 3 دقائق على 4 درجات مئوية ، وإزالة أي مخزن TE المتبقية.
شطف
- إضافة ميكرولتر 210 من شطف والمواد العازلة أزل من الخرز التي يحتضنها الأنابيب في حمام الماء ° 65 مئوية لمدة 15 دقيقة. دوامة لفترة وجيزة في كل دقيقة 2. ويمكن تمديد هذه الحضانة ما دامت 30 دقيقة ، والتي يمكن أن تساعد في تحسين انتعاش شطافة.
- تدور في أسفل الخرز 16000 ز : 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- إزالة 200 ميكرولتر من طاف ونقل إلى أنبوب جديد. يمكن تجميد المواد في -20 درجة مئوية وتخزينها بين عشية وضحاها.
عكس تشعبي
- عكس تشعبي الحمض النووي مناعي من الخطوة ، التي يحتضنها شطف 3 في 65 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 6 ساعات وبحد أقصى 15 ساعة (أوقات أطول من انعكاس تشعبي النتيجة عادة زيادة في الضوضاء في التحليل ميكروأري). ويمكن أن يتم هذا الاحتضان في الفرن حتى يسخن الأنبوب بالتساوي وليس هناك أقل التكثيف تشكيلها.
- أذاب 50 ميكروليتر من الحمض النووي بعد إدخال محفوظة صوتنة (الخطوة 13) ، وإضافة 150 ميكرولتر (3 مجلدات) من شطف العازلة والمزيج. تشعبي عكس هذا الحمض النووي المدخلات التي يحتضنها عند 65 درجة مئوية كما هو الحال في تشعبي عكس ، الخطوة 1. من هذه النقطة ، يعتبر كل من أنبوب مناعي أو إدخال الحمض النووي لتكون منفصلة أو أنبوب عينة للتجهيز في وقت لاحق الخطوات.
تنقية الحمض النووي
- إضافة 8 ميكرولتر من 10 مل RNaseA - 1 ملغ (0.2 مل تركيز ملغ - 1 النهائي) ، ومزيج من قبل مرات عدة قلب الأنبوب واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
- إضافة 4 ميكرولتر من 20 ملغ مل - 1 ح 2 ك بروتين (0.2 ميكروغرام - 1 مل تركيز النهائي) وتخلط بواسطة أنبوب عكس درجة مئوية عدة مرات ، واحتضان لفي 55
- إضافة 400 الفينول ميكرولتر : كلوروفورم : كحول أيزو أميلي (P : C : IA) ، ودوامة مراحل منفصلة مع 2 مل أنبوب Phaselock الثقيلة (اتبع التعليمات التي تقدمها إيبندورف).
- إذا كان P : C : حل الجيش العراقي قديمة أو هي في انخفاض الرقم الهيدروجيني ، وسوف يكون هناك degradation من الحمض النووي ، مما تسبب الضوضاء في التحليل وفقدان ميكروأري الكشف عن أهداف صالحة.
- طبقة نقل مائي لأنبوب الطرد المركزي الجديدة التي تحتوي على 16 ميكرولتر من كلوريد الصوديوم 5M (200 ملم) تركيز النهائي) و 1.5 ميكرولتر من 20 ميكرولتر μ - 1 الجليكوجين (30 ميكروغرام إجمالي).
- إضافة 800 EtOH ميكرولتر. احتضان ليلة وضحاها في -20 درجة مئوية أو 30 دقيقة في -80 درجة مئوية.
- تدور ز 20000 لمدة 10 دقيقة في الحمض النووي لبيليه 4 درجات مئوية. غسل الكريات بإضافة 500 ميكرولتر من EtOH 80 ٪ ، لتكوير vortexing resuspend ومرة أخرى في الغزل 20000 ز لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية.
- إزالة أي EtOH المتبقية 80 ٪. تدور الأنابيب لفترة وجيزة لجمع أي السائل المتبقية وإزالة السائل مع pipetteman ، وتجنب بيليه. اسمحوا أنابيب الهواء الجاف حتى الكريات جافة فقط : يجب أن تحتفظ كريات مظهر رطبة. Resuspend كل بيليه في 70 ميكرولتر من 10 ملي تريس ، حمض الهيدروكلوريك ، ودرجة الحموضة 8.0.
- ويمكن لهذه الكريات Overdrying تجعل من الصعب resuspend ، أو عرضة للتقشر وقشر بعيدا من الجانب من الأنبوب.
- اختياري : حفظ 15 ميكرولتر من عينة مناعي لاستخدامها في المستقبل. يمكن استخدام هذه المواد لأداء الجينات المحددة PCR تأكيد النتائج ميكروأري.
- قياس تركيز من امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (260 نانومتر).
ملاحظة : الخطوات التالية بما في ذلك إعداد المكتبة والتضخيم استخدام GenomePLex تعديل WGA عدة مع مزيج من الأمبير 10X سيغما دون dNTPs :
إعداد المكتبة
متوفر في عدة WGA GenomePLex مع مزيج من الأمبير 10X سيغما
- إضافة 2 ميكرولتر من 1X مكتبة العازلة تحضير إلى 10 ميكرولتر من عينة من الحمض النووي DNA تنقية ، الخطوة 11 في أنبوب PCR.
- إضافة 1 ميكرولتر من الحل لتحقيق الاستقرار المكتبة.
- دوامة بدقة ، وتوطيد بواسطة الطرد المركزي ، ومكانته في cycler الحراري في 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- تبريد العينة على الجليد ، وتوطيد بواسطة الطرد المركزي بواسطة الطرد المركزي ، ومن ثم العودة إلى الجليد.
- إضافة 1 ميكرولتر من أنزيم إعداد المكتبة ، دوامة بدقة ، وأجهزة الطرد المركزي ثم فترة وجيزة.
- عينة مكان في cycler الحرارية واحتضان على النحو التالي :
- 16 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة
- 24 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة
- 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة
- 75 درجة مئوية لمدة 5 دقائق
- 4 درجات مئوية عقد
- إزالة عينات من cycler الحرارية لفترة وجيزة والطرد المركزي. قد تكون ضخمت أو تخزين العينات على الفور عند 20 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.
توسيع
متوفر في عدة WGA GenomePLex مع مزيج من الأمبير 10X سيغما
- ويتم إعداد مزيج الرئيسي بإضافة الكواشف التالية إلى رد فعل 15 ميكرولتر من الخطوة 3 أدناه :
- 7.5 ميكرولتر من مزيج الأمبير 10X (بدون dNTPs)
- 5.0 ميكرولتر من البلمرة DNA WGA
- 3.0 ميكرولتر من dNTP 10 ملم (كل) سهم (تركيز النهائي 0.4 ملم)
- جلب حجم رد الفعل النهائي إلى 75 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه
- دوامة بدقة. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة ، وتبدأ thermocycling.
- تمسخ الأولي 95 درجة مئوية لمدة 3 دقائق
- تنفيذ 14 دورة على النحو التالي :
- تفسد 94 درجة مئوية لمدة 15 ثانية
- يصلب / توسيع لمدة 5 دقائق 65 درجة مئوية
- تنقية تنقية الحمض النووي مع مجموعة من PCR ® Quiagen وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وقياس تركيز من امتصاص الأشعة فوق البنفسجية (260 نانومتر).
- مرة أخرى تنفيذ حلقة من التضخيم من إعداد المكتبة ، الخطوة 1 من خلال التضخيم ، الخطوة 2 ، مع التعديلات التالية.
• وفيما يتعلق كمية من الحمض النووي المطلوبة من الخطوة 3 أعلاه ، للشروع في عملية تجزئة : إذا كان تركيز الحمض النووي حوالي 200-300 ميكروغرام / لتر ، 2.5 ميكرولتر من استخدام العينة وضبط مع الماء لحجم النهائي في 10 ميكرولتر.
إذا كان تركيز الحمض النووي هو حوالي 50-60 ميكروغرام / لتر ، 5 ميكرولتر من استخدام العينة وضبط مع الماء لحجم النهائي في 10 ميكرولتر.
• وفي هذه العملية التضخيم الثانية ، مع dNTPs dTTPs لمزيج الرئيسي هو تبادل لمزيج بما dATP 10 ملم ، 10 ملم dGTP ، و 10 ملم و 8 dCTP dTTP ملم و 2 ملم على dUTP تركيز نفسه ان المزيج السابق. - قياس الحمض النووي باستخدام الأشعة فوق البنفسجية تجاه معمل (260 نانومتر). عادة ، يتم الحصول على قدر أكبر من 9 ميكروغرام من الحمض النووي من كل تضخيم رد الفعل.
ملاحظة : يتم تنفيذ وسم الأهداف الحمض النووي مع GeneChip ® WT الطرفية الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل مجموعة من Affymetrix وسمها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة ، كما هو موضح أدناه :
أهداف تضخيم شظية
- وسوف جزء العينات باستخدام الجدول أدناه المناسبة اعتمادا على ما صفيف نوع أن يكون الهدف الهجينلأوتوماتيكية.
الجدول 1. ميكس تجزئة للصفائف واحدة
متوفر في ® GeneChip WT كيت الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل وسمها الطرفية من Affymetrixحجم المكون / 1 المبلغ في Rxn الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل 7.5 ميكروغرام 10X [كدنا] تجزؤ 4.8 ميكرولتر UDG ، 10 U / ميكرولتر 1.5 ميكرولتر APE 1 ، 100 U / ميكروليتر 2.25 ميكرولتر Nuclease خالية من المياه تصل إلى 48 ميكرولتر
الجدول 2. ميكس تجزئة لمجموعة مجموعات متعددة
متوفر في ® GeneChip WT كيت الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل وسمها الطرفية من Affymetrixحجم المكون / 1 المبلغ في Rxn المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي 9 ميكروغرام 10X [كدنا] تجزؤ 4.8 ميكرولتر UDG ، 10 U / ميكرولتر 1.5 ميكرولتر APE 1 ، 100 U / ميكروليتر 2.25 ميكرولتر Nuclease خالية من المياه يصل إلى 48 - إعداد مزيج التجزئة وفقا لجداول إما أعلاه. نفض الغبار مزيج وتدور باستمرار الأنابيب.
- احتضان ردود الفعل على العنوان التالي :
- 37 درجة مئوية لمدة ساعة 1
- 93 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 دقيقة.
- نفض الغبار مزيج ، وتدور إلى أسفل الأنابيب ، ونقل 45 ميكرولتر من العينة لأنبوب جديد.
- 2 ميكرولتر من إزالة كل عينة لهلام تحول التحليل.
التسمية مجزأة المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي
- إعداد وسمها الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ميكس كما هو موضح في الجدول أدناه :
الجدول 3. تركيبة الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل ميكس وسمها
متوفر في ® GeneChip WT كيت الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل وسمها الطرفية من Affymetrixحجم المكون / 1 المبلغ في Rxn 5X TDT العازلة 12 ميكرولتر TDT 2 ميكرولتر الحمض النووي الكاشف وسمها ، 5 ملي 1 ميكرولتر اجمالى حجم 15 ميكرولتر - إضافة 15 ميكرولتر مزيج من الحمض النووي وصفها المزدوج تقطعت بهم السبل على عينات من الحمض النووي ، ونفض الغبار المزيج ، وتدور عليهم.
- احتضان ردود الفعل على العنوان التالي :
- 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة.
- 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
- 4 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 دقيقة.
- 2 ميكرولتر من إزالة كل عينة لهلام تحول التحليل.
هلام تحول التحليل
- إعداد agarose هلام 4 ٪.
- احتضان عينات من الأهداف قطعة تضخيمها ، الخطوة (5) وتسمية مجزأة المزدوج تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، والخطوة 4 في 65 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- أضف 10 ميكرولتر من Streptavidin (1 ملغ / مل) ، واحتضان عينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تشغيل عينات من الخطوة 3 على 4 ٪ agarose هلام (جل التحول التحليل ، الخطوة 1) للتحقق من الهجرة التحول من المنتجات التوسيم.
والتهجين مجموعة صفيف الغسيل
التي يؤديها مركز الجينوم في جامعة ريفرسايد في كاليفورنيا.
مصفوفة تحليل
تحليل الحسابية التي يؤديها.
BUFFER المؤلفات :
كتلة الحل : برنامج تلفزيوني + 0.5 ٪ الأبقار مصل الزلال (BSA).
الاحتياطي تحلل : 50 مم HEPES - KOH ، ودرجة الحموضة 7.5
140 مم كلوريد الصوديوم
1 ملم EDTA
1 ٪ تريتون X - 100
0.1 ٪ SDS
1MM PMSF
الرقم الهيدروجيني 7،5 النهائي
IP1 : الاحتياطي تحلل كلوريد الصوديوم + 500 ملي
IP2 : 10 مم ، تريس حمض الهيدروكلوريك
250 ملم LiCl
1 ملم EDTA
0.5 ٪ NP - 40
0.5 ٪ الصوديوم Dioxycholat
الرقم الهيدروجيني 8،0 النهائي
TE : 10 مم تريس ، ودرجة الحموضة 7.4
1 ملم EDTA
الرقم الهيدروجيني 8،0 النهائي
شطف الاحتياطي : TE العازلة + 1 ٪ SDS.
Discussion
مناعي لونين (CHIP) تقدم تقنية قيمة للتشريح لونين المستندة إلى العمليات خلال تمايز الخلايا. الشروط الأساسية لنجاح هذه الطريقة هي أضداد جيدة وتوافر لونين من الخلايا أو الأنسجة السيطرة التي تفتقر إلى المستضد من الفائدة. ويمكن من خلال الجمع بين رقاقة مع الحمض النووي استخدموا تكنولوجيا متطورة ، وكميات هائلة من المعلومات يمكن الحصول عليها. والتحقق من النتائج الشذرة يعتمد على توافر نظم الاختبار المناسبة التي يمكن الربط بين الجمعيات الحيوية للبروتينات ، والتعديلات البروتين و / أو RNA مع تنفيذ العمليات البيولوجية أثناء تطوير الخلية.
Acknowledgments
ويدعم العمل التي قدمتها منحة (RS1 - 00477-1) من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) لFS
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Poteinase-K | Reagent | Roche Group | #EO0491 | |
| RNase-A | Reagent | Fermentas | #EN0531 | |
| formaldehyde 37% | Reagent | EMD Millipore | FX040-13 | |
| Chloroform | Reagent | EMD Millipore | 3150 | |
| Ethanol | Reagent | Goldshield | ||
| phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Reagent | Invitrogen | 15593-031 | |
| SA, fraction V | Reagent | EMD Millipore | 2930 | |
| Dubecco’s Phosphate Buffered Saline | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190 | |
| HEPES | Reagent | EMD Millipore | 5330 | |
| Sodium Chloride | Reagent | Fisher Scientific | S271-10 | |
| EDTA | Reagent | EMD Millipore | 4050 | |
| Triton X-100 | Reagent | EMD Millipore | 9410 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Reagent | JT Baker | 4095-02 | |
| Lithium chloride | Reagent | EMD Millipore | 5910 | |
| Tris-HCl | Reagent | EMD Millipore | 9230 | |
| NP-40 | Reagent | Calbiochem | 492015 | |
| Deoxycholic acid, sodium salt | Reagent | Fisher Scientific | BP349-100 | |
| Ammonium acetate | Reagent | Applichem | 631-61-8 | |
| Glycine | Reagent | EMD Millipore | 4840 | |
| Glycine | Reagent | EMD Millipore | 4840 | |
| dynalbeads, protein A | Reagent | Invitrogen | 100.02D | |
| dynalbeads, protein G | Reagent | Invitrogen | 100.04D | |
| 1.5ml Low Retention Microtubes, Xtreme | Other | Phenix Research Products | MAX-815S | |
| Phase Lock Gel Light, 2.0 ml | Reagent | Eppendorf | 955154037 |
References
- Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
- Boyer, L. A., et al. Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Nature. 441, 349-353 (2006).
- Lee, T. I., et al. Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell. 125, 301-313 (2006).
- Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome. Cell. 98, 285-294 (1999).
- Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).
- Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).
- Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax. Science. 311, 1118-1123 (2006).
