Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से chromatin immunoprecipitation

doi: 10.3791/780 Published: July 22, 2008

Summary

ईएससी के भेदभाव संरचना में सेल प्रकार विशिष्ट परिवर्तन और chromatin की संरचना के साथ मेल खाता है. उन परिवर्तनों का पता लगाने तंत्र है कि stemcellness और सेल भेदभाव को परिभाषित करने में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान करता है. Chromatin immunoprecipitation (चिप) एक मूल्यवान आणविक स्टेम सेल भेदभाव अंतर्निहित तंत्र को काटना विधि का प्रतिनिधित्व करता है.

Protocol

विगलन ES कोशिकाओं (वीडियो में प्रदर्शित नहीं)

ES कोशिकाओं को 10% DMSO के माध्यम युक्त में जमे हुए हैं. चूंकि DMSO ES कोशिकाओं की भिन्नता पैदा कर सकते हैं, यह संभव हो सकता है दिन में देर कोशिकाओं गल कर सकते हैं और तो निम्नलिखित सुबह मध्यम बदलने के अवशिष्ट DMSO के प्रभाव को कम करने.

  1. कोट एक ऊतक के साथ 0.1% कम से कम 15 मिनट के लिए जिलेटिन 6 अच्छी तरह से संस्कृति की थाली और बंद पर थाली कोशिकाओं को पहले तुरंत aspirate.
  2. पिघलना एक 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ES कोशिकाओं (लगभग 5 × 10 6 कोशिकाओं, एक मिला हुआ 6 अच्छी तरह से करने के लिए बराबर) और prewarmed ES सेल के माध्यम से 10 मिलीलीटर में जलमिश्रित.
  3. गोली एक पीठ टॉप नैदानिक ​​अपकेंद्रित्र में 1000 rpm पर 10 मिनट के लिए कताई से कोशिकाओं.
  4. 37 डिग्री सेल्सियस prewarmed माध्यम के 10 मिलीलीटर में मध्यम और धीरे resuspend कोशिकाओं Aspirate.
  5. 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए स्थानांतरण कक्ष निलंबन और 37 से बढ़ने ° humidified 5% सीओ 2 इनक्यूबेटर में सी.
  6. अगले दिन मध्यम बदलें मृत कोशिकाओं और अवशिष्ट DMSO निकालना.

ES सेल संस्कृतियों के पारित होने और विस्तार

ES कोशिकाओं नियमित हर 2 / 3 दिनों passaged हैं, और मध्यम वैकल्पिक दिनों पर बदल रहा है. इस प्रकार, ES कोशिकाओं को दैनिक ध्यान की आवश्यकता होती है. हमारे अनुभव में, फीडर स्वतंत्र ES कोशिकाओं तेजी से बढ़ने और जल्दी से मध्यम acidify, यह पीले मोड़. कोशिकाओं मध्यम अम्ल (बदलते हर दिन नहीं मीडिया या बहुत कम एक कमजोर पड़ने पर passaging कोशिकाओं द्वारा) अनुमति दे कोशिकाओं को संकट से गुजरना करने के लिए कारण, अतिरिक्त भेदभाव और कोशिका मृत्यु को ट्रिगर, जिसके बाद उनके totipotency गारंटी नहीं हो सकता. बहुत कम घनत्व, कक्षों की यात्रा के दौरान अपर्याप्त फैलाव, या असमान चढ़ाना चढ़ाना कोशिकाओं को इसी तरह की समस्याओं का कारण है, के रूप में कक्षों संगम तक पहुँचने से पहले बड़े clumps फार्म और इन clumps कोशिकाओं के भीतर अलग होगा या मर कर सकते हैं. Germline संचरण एक महत्वपूर्ण कोशिकाओं है कि mistreated किया गया है, तब भी जब वे इंजेक्शन के समय में स्वस्थ दिखाई देते हैं कम.

  1. कक्षों की एक मिला हुआ 6-अच्छी तरह से थाली के लिए मध्यम aspirate बंद और 37 डिग्री सेल्सियस prewarmed पीबीएस के 2-3 मिली के साथ धोने, यह कोशिकाओं से दूर pipetting.
  2. 1 के 1 मिलीलीटर × 3-4 मिनट के लिए या जब तक कोशिकाओं को समान रूप से छोटे clumps में बिखरे हैं trypsin समाधान के साथ कोशिकाओं को कवर.
  3. Trypsin निष्क्रिय करने के लिए माध्यम की एक मिलीलीटर जोड़ें.
  4. हौसले gelatinized 6 अच्छी तरह से थाली trypsinized कोशिकाओं और प्लेट कोशिकाओं (आमतौर पर 2 / 5) अच्छी तरह से ले लीजिए.

बर्फ़ीली ES कोशिकाओं

  1. मिला हुआ छह अच्छी तरह से थाली (लगभग × 1 10 7 कोशिकाओं) के रूप में ऊपर वर्णित Trypsinize.
  2. 9 १,००० rpm पर 5 मिनट के लिए मध्यम और गोली के मिलीलीटर में trypsinized कोशिकाओं को ले लीजिए.
  3. हौसले से तैयार ठंड मध्यम के 1 मिलीलीटर में मध्यम और resuspend सेल गोली Aspirate. दो cryotubes में कक्षों की 0.5 मिलीलीटर विभाज्य.
  4. -80 पर शीशियों रुक डिग्री सेल्सियस रातोंरात और लंबी अवधि के भंडारण के लिए तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरण.

चिप पर चिप प्रक्रिया

Immunoprecipitation

  1. Formaldehyde crosslinking कोशिकाओं (निलंबन कोशिकाओं के लिए)
    1. 1 x 10 प्रत्येक immunoprecipitation के लिए 8 कोशिकाओं - 5 7 x 10 का प्रयोग करें.
    2. 1% की एकाग्रता में सेल निलंबन ताजा Formaldehyde जोड़ें.
    3. कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए Formaldehyde समाधान के साथ कोशिकाओं Incubates है.
    4. Formaldehyde बुझाने 1.25 एम ग्लाइसिन के 1 / 10 मात्रा जोड़ें.
    5. 1x पीबीएस के 10 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं में दो बार कुल्ला.
    6. 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में पूल कोशिकाओं और 700g में 4 पर 5 मिनट के लिए स्पिन डिग्री सेल्सियस Lysis बफर के 1.5 मिलीलीटर में सतह पर तैरनेवाला और resuspend गोली त्यागें. एक 1.5 मिलीलीटर microfuge ट्यूब में कोशिकाओं का स्थानांतरण.
  2. फ्लैश फ्रीज तरल नाइट्रोजन में तीन बार कोशिकाओं और एक ऊतक की चक्की का उपयोग करने के लिए कोशिकाओं को तोड़ने. एक बार कोशिकाओं Crosslinked कर रहे हैं, वे संग्रहीत किया जा -80 डिग्री सेल्सियस अनिश्चित काल पर जमे हुए हो सकता है.

चुंबकीय मोतियों की तैयारी (चरण सभी 4 डिग्री सेल्सियस प्रदर्शन कर रहे हैं )

  1. 1.5 मिलीलीटर कम प्रतिधारण microtube Dynal मोतियों की 50 μl जोड़ें. Immunoprecipitation प्रति मोतियों की एक ट्यूब सेट. 1 मिलीलीटर ब्लॉक समाधान जोड़ें.
  2. Dynal MPC मोती का उपयोग कर लीजिए. चुंबकीय रैक में रखें ट्यूबों. मोती ट्यूब के पक्ष में एकत्र करने की अनुमति दें. यह लगभग 15 एस लेना चाहिए रैक दो बार उलटें मोती को इकट्ठा करने के लिए मदद. Pipettor के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  3. रैक और inverting रैक से चुंबकीय पट्टी को हटाने में 1 मिलीलीटर ब्लॉक समाधान जोड़ें और धीरे resuspend मोती, अभी भी जगह में ट्यूबों के साथ या तो 10-20 बार, या जब तक मोती resuspend समान रूप से कर रहे हैं. (चरण 2) के ऊपर के रूप में मोती ले लीजिए. Pipettor के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें.
  4. 1.5 मिलीलीटर ब्लॉक समाधान में मोती चरण 3, एक बार और के रूप में, धो.
  5. 750 μl ब्लॉक समाधान में मोती Resuspend और एंटीबॉडी के 10 μg जोड़ने. 4 ° C एक अंग को घुमानेवाली पेशी पर 6 की एक न्यूनतम के लिए या रातोंरात, सेते हैं.
  6. मोती धो तीन टीIMEs 1 मिलीलीटर ब्लॉक समाधान में, के रूप में चरण 3 में वर्णित है.

सेल sonication

  1. -80 से ° sonication के लिए सी और हस्तांतरण ट्यूब कोशिकाओं जमे हुए सेल छर्रों निकालें. वर्तमान में हम sonication के लिए एक मानक polupropylene के नीचे, 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब का उपयोग करना पसंद करते हैं. हम दो टुकड़ों में 5 मिलीलीटर निशान पर ट्यूब कटौती और ऊपरी आधा त्यागें. ट्यूब parafilm या ट्यूब टोपी के साथ कवर किया जा सकता है, जबकि स्थापना.
  2. एक microfuge ट्यूब रैक, स्थिति ट्यूब का उपयोग तो sonicator जांच ट्यूब के नीचे से ऊपर लगभग 0.5-1.0 सेमी बैठता है. ख्याल है कि जांच को केंद्रित है और ट्यूब के पक्ष से संपर्क नहीं ले लो. (जांच पोजीशनिंग समाधान foams चाहे या sonication के दौरान नहीं प्रभावित आमतौर पर, foaming इंगित करता है कि sonicated डीएनए खराब sheared जाएगा. सकते हैं.)
  3. एस 20 के दौरान 6 बार निलंबन Sonicate नमूने sonication के दौरान एक बर्फ के पानी स्नान में रखा जाना चाहिए. Foaming, शुरू में 0 से बिजली उत्पादन सेट कम होती है और अंतिम सत्ता के लिए मैन्युअल रूप से पहले फट के दौरान वृद्धि हुई है. (यदि वहाँ foaming महत्वपूर्ण है, सभी सामग्री के कोमल resuspension द्वारा 20,000 पीछा जी पर सभी बुलबुले centrifugation द्वारा हटा दिया जा सकता है, कोई फोम बुलबुले छोड़ने.)
  4. 20,000 जी में 4 बजे 10 मिनट के लिए स्पिन डिग्री सेल्सियस गोली मलबे और एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में फसल सतह पर तैरनेवाला
  5. इनपुट के डीएनए के रूप में प्रत्येक नमूना से सेल lysate के 50 μl सहेजें. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर कम - से - कम एक इनपुट डीएनए विभाज्य sonicate lysate के प्रति बैच रखा जाना चाहिए. ध्यान दें कि sonication और टुकड़ा आकार के परिणामस्वरूप वितरण के प्रभाव के प्रभाव केवल crosslink उत्क्रमण और डीएनए की शुद्धि के बाद जाँच की जा सकती है.

Chromatin immunoprecipitation

  1. 1 x 10 सेल sonication से 8 कोशिकाओं, 50 μl / एंटीबॉडी चुंबकीय 1 मिलीलीटर की एक अंतिम मात्रा (यह हो सकता है के साथ चुंबकीय मोती, चरण 6 की तैयारी से मोती मिश्रण करने के लिए चरण 4 - 5 10 x 7 के chromatin के बराबर राशि जोड़ें lysis, बफर यदि कभी) के साथ समायोजित करने के लिए संभव है. 4 में अंग को घुमानेवाली पेशी पर रातोंरात सेते ° सी.

धोना

  1. Dynal MPC मोती का उपयोग कर लीजिए. रैक में रखें ट्यूब. मोती ट्यूब के पक्ष में एकत्र करने की अनुमति दें. यह लगभग 20 एस ले जाना चाहिए दो बार रैक सभी मोती को इकट्ठा करने में मदद उलटें. Pipettor के साथ सतह पर तैरनेवाला निकालें, नमूनों के बीच सुझावों को बदलने.
  2. 1 मिलीलीटर प्रत्येक ट्यूब lysis बफर और धीरे resuspend मोती जोड़ें. यह रैक और inverting रैक से चुंबकीय पट्टी को हटाने के द्वारा किया जा सकता है अभी भी जगह में ट्यूबों के साथ 10-20 बार या जब तक मोती समान रूप से resuspended हैं. मोती ले लीजिए. निकालें सतह पर तैरनेवाला pipettor द्वारा. इस धोने 5 से अधिक बार दोहराएँ, washes के बीच सुझावों बदलते.
  3. मोती 1 मिलीलीटर IP1 बफर के रूप में चरण 2 में वर्णित में 6 बार धोएं.
  4. मोती 1 मिलीलीटर IP2 बफर में 6 बार धो, के रूप में चरण 2 में वर्णित.
  5. मोती 1 मिलीलीटर ते 8.0 बफर के रूप में चरण 2 में वर्णित में 6 बार धोएं.
  6. 4 में 3 मिनट के लिए 960g में स्पिन डिग्री सेल्सियस और किसी भी अवशिष्ट ते बफर हटा.

Elution

  1. मोतियों से 15 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में ट्यूबों incubating Elution बफर और elute सामग्री के 210 μl जोड़ें. संक्षेप में हर 2 मिनट भंवर. यह ऊष्मायन 30 मिनट है, जो eluate की वसूली में सुधार करने में मदद कर सकते हैं के रूप में लंबे समय के रूप में बढ़ाया जा सकता है है.
  2. नीचे कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए 16,000 ग्राम पर मोती स्पिन.
  3. निकालें सतह पर तैरनेवाला के 200 μl और नया ट्यूब को हस्तांतरण. सामग्री -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए किया जा सकता है और रात भर संग्रहीत.

Crosslink उत्क्रमण

  1. रिवर्स Elution, चरण 3 से 6 घंटे और 15 घंटे (crosslink उत्क्रमण का लंबा समय आमतौर पर माइक्रोएरे विश्लेषण में वृद्धि हुई शोर में परिणाम) की एक अधिकतम की एक न्यूनतम के लिए 65 ° सी में incubating immunoprecipitation डीएनए crosslink. इस ऊष्मायन एक ओवन में किया जा सकता है इतना है कि ट्यूब समान रूप से गर्म है और वहाँ कम गठन संक्षेपण है.
  2. इनपुट sonication के बाद सुरक्षित डीएनए (13 चरण) के 50 μl पहले गला लें, elution बफर और मिश्रण के 150 μl (3 मात्रा) जोड़ें. 65 में incubating डिग्री सेल्सियस Crosslink उत्क्रमण, चरण 1 के रूप में इस इनपुट डीएनए crosslink रिवर्स . इस बिंदु से, immunoprecipitation इनपुट या डीएनए के हर ट्यूब के लिए एक अलग या बाद के चरणों के प्रसंस्करण के लिए ट्यूब नमूना माना जाता है.

शोधन डीएनए

  1. 10 मिलीग्राम RNaseA मिलीलीटर-1 (0.2 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 अंतिम एकाग्रता) के 8 μl, inverting ट्यूब कई बार द्वारा मिश्रण जोड़ें और सेते में 37 एच. 2 ° C
  2. 20 मिलीग्राम मिलीलीटर-1 proteinase (0.2 μg मिलीलीटर-1 अंतिम एकाग्रता) कश्मीर और inverting ट्यूब 55 में कई बार और सेते डिग्री सेल्सियस के लिए मिश्रण 2 एच. के 4 μl जोड़ें
  3. क्लोरोफॉर्म: 400 μl phenol जोड़ें isoamyl (C: पी आइए) शराब, भंवर और 2 मिलीलीटर भारी Phaselock ट्यूब (Eppendorf द्वारा दिए गए निर्देशों का का पालन करें) के साथ अलग - अलग चरणों.
  4. यदि पी सी: आइए समाधान पुराना है या कम pH पर है, वहाँ degr जाएगाडीएनए के adation, माइक्रोएरे विश्लेषण और वैध लक्ष्य का पता लगाने के के नुकसान में शोर के कारण.
  5. नए 5M NaCl (200 मिमी) अंतिम एकाग्रता) के 16 μl और 20 μ के 1.5 μl μl-1 ग्लाइकोजन (30 μg कुल). अपकेंद्रित्र युक्त ट्यूब जलीय परत स्थानांतरण
  6. 800 μl EtOH जोड़ें. -20 डिग्री सी या 30 मिनट -80 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए सेते
  7. 4 में 10 मिनट के लिए 20,000 ग्राम में स्पिन ° गोली डीएनए सी. 80% EtOH के 500 μl जोड़ने resuspend गोली vortexing और 20,000 जी पर फिर से 5 मिनट के लिए 4 में कताई डिग्री सेल्सियस से छर्रों धो
  8. किसी भी शेष 80% EtOH निकालें. ट्यूबों संक्षेप में स्पिन करने के लिए किसी भी शेष तरल को इकट्ठा करने और एक pipetteman साथ तरल निकालने के लिए, गोली से बचने के लिए. ट्यूबों शुष्क हवा जब तक छर्रों की बस सूख रहे हैं: छर्रों अभी भी एक नम उपस्थिति बनाए रखने चाहिए. 10 मिमी Tris - एचसीएल, पीएच 8.0 70 μl में प्रत्येक गोली Resuspend.
  9. इन छर्रों के Overdrying उन्हें resuspend मुश्किल है, या परत छील और ट्यूब की ओर से दूर करने के लिए उत्तरदायी कर सकते हैं.
  10. वैकल्पिक: भविष्य में उपयोग के लिए immunoprecipitation नमूना के 15 μl सहेजें. इस सामग्री के लिए विशिष्ट जीन माइक्रोएरे परिणाम की पीसीआर पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  11. यूवी अवशोषण (260 एनएम) के द्वारा एकाग्रता यों.

एनबी: पुस्तकालय तैयारी और प्रवर्धन dNTPs बिना सिग्मा से 10X Amp मिक्स के साथ एक संशोधित GenomePLex WGA किट का उपयोग सहित निम्न चरणों:

पुस्तकालय की तैयारी

सिग्मा से 10X Amp मिक्स के साथ GenomePLex WGA किट में उपलब्ध

  1. शोधन डीएनए, एक पीसीआर ट्यूब में 11 कदम से डीएनए नमूने के 10 μl 1X लाइब्रेरी तैयार बफर के 2 μl जोड़ें.
  2. पुस्तकालय स्थिरीकरण समाधान के 1 μl जोड़ें.
  3. भंवर अच्छी तरह से, centrifugation द्वारा मजबूत, और 95 में थर्मल cycler में जगह डिग्री सेल्सियस 2 मिनट के लिए.
  4. बर्फ पर नमूना कूल, centrifugation द्वारा centrifugation द्वारा मजबूत है, और फिर बर्फ पर लौटने.
  5. 1 μl लाइब्रेरी तैयार एनजाइम के, अच्छी तरह से भंवर, और फिर संक्षिप्त अपकेंद्रित्र जोड़ें.
  6. एक थर्मल cycler और के रूप में सेते में रखें नमूना इस प्रकार है:
    • 16 ° C 20 मिनट के लिए
    • 24 ° C 20 मिनट के लिए
    • 37 ° C 20 मिनट के लिए
    • 75 ° 5 मिनट के लिए सी
    • 4 ° सी पकड़
  7. थर्मल cycler और अपकेंद्रित्र संक्षिप्त से नमूने निकालें. नमूने तुरंत परिलक्षित हो सकता है या 20 ° तीन दिन के लिए सी संग्रहीत.

प्रवर्धन

सिग्मा से 10X Amp मिक्स के साथ GenomePLex WGA किट में उपलब्ध

  1. एक मास्टर मिश्रण चरण 3 से 15 μl प्रतिक्रिया निम्नलिखित अभिकर्मकों जोड़कर तैयार किया जाता है नीचे,
    • 10X Amp मिक्स के 7.5 μl (dNTPs के बिना)
    • WGA डीएनए पोलीमरेज़ के 5.0 μl
    • एक 10 मिमी (प्रत्येक) शेयर (अंतिम एकाग्रता 0.4 मिमी) dNTP के 3.0 μl
    • Nuclease मुक्त पानी के साथ 75 μl अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा लाओ
  2. अच्छी तरह भंवर. संक्षेप में, अपकेंद्रित्र, और thermocycling शुरू.
    • प्रारंभिक denaturation 95 ° C 3 मिनट के लिए
    • निम्नानुसार 14 चक्रों प्रदर्शन:
    • 94 denature ° 15 सेकंड के लिए सी
    • / पानी रखना 65 बढ़ाएँ ° 5 मिनट के लिए सी
    साइकिल चालन के बाद पूरा हो गया है, 4 में प्रतिक्रियाओं बनाए रखने डिग्री सेल्सियस या विश्लेषण या शुद्धि के लिए तैयार है जब तक -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान.
  3. Quiagen से निर्माता के निर्देशों के अनुसार पीसीआर शोधन के साथ डीएनए ® किट और शुद्ध यूवी अवशोषण (260 एनएम) के द्वारा एकाग्रता यों.
  4. फिर पुस्तकालय तैयारी से प्रवर्धन के एक चक्र का प्रदर्शन करने के लिए निम्नलिखित रूपांतरों के साथ के माध्यम से प्रवर्धन, चरण 2 1, चरण.

    चरण 3, ऊपर, विखंडन प्रक्रिया आरंभ से आवश्यक डीएनए की राशि के संबंध: यदि डीएनए की एकाग्रता 200-300 के आसपास है / μg मिलीलीटर, नमूने के 2.5 μl का उपयोग करें और 10 μl के अंतिम मात्रा के लिए पानी के साथ समायोजित.
    यदि डीएनए की एकाग्रता 50-60 μg / मिलीलीटर के आसपास है, नमूना के 5 μl का उपयोग करें और 10 μl के अंतिम मात्रा के लिए पानी के साथ समायोजित.


    • इस दूसरी प्रवर्धन प्रक्रिया में, मास्टर मिश्रण के लिए dTTPs साथ dNTPs 10 मिमी dATP, 10 मिमी dGTP, 10 मिमी dCTP और 8 मिमी dTTP और एक ही एकाग्रता है कि पिछले मिश्रण में 2 मिमी dUTP सहित एक मिश्रण के लिए विदेशी मुद्रा है.

  5. उपाय यूवी विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग डीएनए (260 एनएम). आम तौर पर, प्रवर्धित डीएनए की अधिक से अधिक 9 μg प्रत्येक प्रतिक्रिया से प्राप्त की है.

    एनबी: GeneChip डीएनए लक्ष्य के लेबलिंग के साथ किया जाता है ® WT Affymetrix से डबल असहाय डीएनए टर्मिनल लेबलिंग किट निर्माता के निर्देशों के अनुसार, के रूप में नीचे वर्णित हैं:

टुकड़ा प्रवर्धित लक्ष्य

  1. टुकड़ा नमूने सरणी क्या लक्ष्य टाइप पर निर्भर करता है नीचे उचित तालिका का उपयोग संकर जाएगाके लिए ized.

    तालिका 1. एकल arrays के लिए विखंडन मिक्स
    घटक / 1 Rxn में वॉल्यूम राशि
    डबल असहाय 7.5 μg डीएनए
    10X सीडीएनए विखंडन μl 4.8
    UDG, 10 यू / μl 1.5 μl
    1 बंदर, 100 यू / μl 2.25 μl
    Nuclease मुक्त 48 μl पानी
    GeneChip ® WT Affymetrix से डबल असहाय डीएनए टर्मिनल लेबलिंग किट में उपलब्ध

    तालिका 2. बहु सरणी सेट के लिए विखंडन मिक्स
    घटक / 1 Rxn में वॉल्यूम राशि
    डबल असहाय 9 μg डीएनए
    10X सीडीएनए विखंडन μl 4.8
    UDG, 10 यू / μl 1.5 μl
    1 बंदर, 100 यू / μl 2.25 μl
    Nuclease मुक्त 48 से ऊपर पानी
    GeneChip ® WT Affymetrix से डबल असहाय डीएनए टर्मिनल लेबलिंग किट में उपलब्ध
  2. या तो ऊपर टेबल्स के अनुसार विखंडन मिश्रण सेट. झाड़ मिश्रण और नीचे ट्यूबों स्पिन.
  3. पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं:
    • 37 ° 1 एच. के लिए सी
    • 93 ° 2 मिनट के लिए सी.
    • 4 ° सी कम से कम 2 मिनट के लिए.
  4. झाड़ - मिश्रण, नीचे ट्यूबों स्पिन, और एक नया ट्यूब के लिए नमूने के 45 μl हस्तांतरण.
  5. जेल बदलाव विश्लेषण के लिए प्रत्येक नमूना के 2 μl निकालें.

लेबल खंडित डीएनए डबल असहाय

  1. डीएनए डबल असहाय लेबलिंग के रूप में नीचे दी गई सारणी में वर्णित मिक्स तैयार:

    तालिका 3. डबल असहाय डीएनए लेबलिंग मिक्स की संरचना
    घटक / 1 Rxn में वॉल्यूम राशि
    5X TDT बफर μl 12
    TDT 2 μl
    डीएनए लेबलिंग अभिकर्मक, 5 मिमी 1 μl
    कुल मात्रा 15 μl
    GeneChip ® WT Affymetrix से डबल असहाय डीएनए टर्मिनल लेबलिंग किट में उपलब्ध
  2. डीएनए नमूने, झटका मिश्रण, डबल असहाय डीएनए लेबल मिक्स 15 μl जोड़ें और उन्हें स्पिन नीचे.
  3. पर प्रतिक्रियाओं सेते हैं:
    • 37 ° सी 60 मिनट के लिए.
    • 70 ° C 10 मिनट के लिए.
    • 4 ° सी कम से कम 2 मिनट के लिए.
  4. जेल बदलाव विश्लेषण के लिए प्रत्येक नमूना के 2 μl निकालें.

जेल शिफ्ट विश्लेषण

  1. एक 4% agarose जेल तैयार.
  2. टुकड़ा प्रवर्धित लक्ष्य, चरण 5 और लेबल खंडित डबल असहाय डीएनए, चरण 65 में 4 ° सी 2 मिनट के लिए नमूनों को सेते हैं.
  3. Streptavidin (1 मिलीग्राम / एमएल) का 10 μl, और 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर सेते नमूने जोड़ें.
  4. एक 4% agarose जेल पर चरण 3 (विश्लेषण जेल - पाली, चरण 1) से नमूने को चलाने के लिए लेबलिंग उत्पादों के बदलाव प्रवास की जांच करने के लिए.

ऐरे संकरण और धोने ऐरे

कैलिफोर्निया रिवरसाइड विश्वविद्यालय के जीनोमिक सेंटर द्वारा प्रदर्शन किया.

ऐरे विश्लेषण

कम्प्यूटेशनल विश्लेषण के द्वारा प्रदर्शन किया.

बफर रचनाएँ:

ब्लॉक समाधान: पीबीएस + 0.5% गोजातीय सीरम albumin (BSA).

Lysis बफर: 50 मिमी HEPES - KOH, 7.5 पीएच
140 मिमी NaCl
1 मिमी EDTA
% 1 X-100 ट्राइटन
0.1% एसडीएस
1mm PMSF
अंतिम पीएच 7.5

IP1: lysis बफर + 500 मिमी NaCl

IP2: 10 मिमी Tris - एचसीएल
250 मिमी LiCl
1 मिमी EDTA
0.5% एनपी 40
0.5% सोडियम Dioxycholat
अंतिम 8.0 पीएच

ते: 10 मिमी Tris, 7.4 पीएच
1 मिमी EDTA

अंतिम 8.0 पीएच
Elution बफर ते बफर + 1% एसडीएस.

Discussion

Chromatin immunoprecipitation (चिप) सेलुलर भेदभाव के दौरान chromatin आधारित प्रक्रियाओं के विच्छेदन के लिए एक मूल्यवान तकनीक प्रदान करता है. इस विधि की सफलता के लिए पूर्वापेक्षाएँ अच्छा एंटीबॉडी और नियंत्रण की कोशिकाओं या ऊतकों है कि ब्याज की प्रतिजन कमी से chromatin की उपलब्धता की हैं. डीएनए माइक्रोएरे प्रौद्योगिकी, सूचना के विशाल मात्रा के साथ चिप के संयोजन से प्राप्त किया जा सकता है. चिप परिणामों के सत्यापन उपयुक्त परीक्षण प्रणाली है कि सेल के विकास के दौरान जैविक प्रक्रियाओं के निष्पादन के साथ प्रोटीन की गतिशील संघ, प्रोटीन संशोधनों और / या शाही सेना लिंक कर सकते हैं की उपलब्धता पर निर्भर करता है.

Acknowledgments

प्रस्तुत काम एफएस के लिए पुनर्योजी चिकित्सा के लिए कैलिफोर्निया इंस्टीट्यूट (सीआईआरएम) से एक अनुदान (RS1 00,477 - 1) द्वारा समर्थित है

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Poteinase-K Reagent Roche Group #EO0491
RNase-A Reagent Fermentas #EN0531
formaldehyde 37% Reagent EMD Millipore FX040-13
Chloroform Reagent EMD Millipore 3150
Ethanol Reagent Goldshield
phenol:chloroform:isoamyl alcohol Reagent Invitrogen 15593-031
SA, fraction V Reagent EMD Millipore 2930
Dubecco’s Phosphate Buffered Saline Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190
HEPES Reagent EMD Millipore 5330
Sodium Chloride Reagent Fisher Scientific S271-10
EDTA Reagent EMD Millipore 4050
Triton X-100 Reagent EMD Millipore 9410
Sodium Dodecyl Sulfate Reagent JT Baker 4095-02
Lithium chloride Reagent EMD Millipore 5910
Tris-HCl Reagent EMD Millipore 9230
NP-40 Reagent Calbiochem 492015
Deoxycholic acid, sodium salt Reagent Fisher Scientific BP349-100
Ammonium acetate Reagent Applichem 631-61-8
Glycine Reagent EMD Millipore 4840
Glycine Reagent EMD Millipore 4840
dynalbeads, protein A Reagent Invitrogen 100.02D
dynalbeads, protein G Reagent Invitrogen 100.04D
1.5ml Low Retention Microtubes, Xtreme Other Phenix Research Products MAX-815S
Phase Lock Gel Light, 2.0 ml Reagent Eppendorf 955154037

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Evans, M. J., Kaufman, M. H. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature. 292, 154-156 (1981).
  2. Boyer, L. A., et al. Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells. Nature. 441, 349-353 (2006).
  3. Lee, T. I., et al. Control of developmental regulators by Polycomb in human embryonic stem cells. Cell. 125, 301-313 (2006).
  4. Kornberg, R. D., Lorch, Y. Twenty-five years of the nucleosome, fundamental particle of the eukaryotic chromosome. Cell. 98, 285-294 (1999).
  5. Guenther, M. G., Jenner, R. G., Chevalier, B., Nakamura, T., Croce, C. M., Canaani, E., Young, R. A. Global and Hox-specific roles for the MLL1 methyltransferase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.. 102, 8603-8608 (2005).
  6. Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location. Nat. Protoc. 1, 729-748 (2006).
  7. Sanchez-Elsner, T., Gou, D., Kremmer, E., Sauer, F. Noncoding RNAs of trithorax response elements recruit Drosophila Ash1 to Ultrabithorax. Science. 311, 1118-1123 (2006).
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं से chromatin immunoprecipitation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bertani, S., Kan, A., Sauer, F. Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (17), e780, doi:10.3791/780 (2008).More

Bertani, S., Kan, A., Sauer, F. Chromatin Immunoprecipitation from Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (17), e780, doi:10.3791/780 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter