Biology

प्रारंभिक murine जर्दी Sac और एजीएम से hematopoietic स्टेम सेल का अलगाव

Published: June 27, 2008 doi: 10.3791/789

Kelly Morgan¹, Michael Kharas¹, Elaine Dzierzak², D. Gary Gilliland^1,3

¹Department of Hematology and Oncology, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, ²Department of Cell Biology and Genetics, Erasmus University Medical Center, ³Department of Medicine, Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

Summary

इस वीडियो से पता चलता है कैसे जर्दी थैली और महाधमनी - जननपिंड mesonephros क्षेत्र भ्रूण से सूक्ष्म काटना और प्रवाह cytometry का उपयोग करने के लिए hematopoietic स्टेम सेल तरह.

Abstract

माउस भ्रूण में, जल्दी hematopoiesis कई अंगों, जो जर्दी थैली और महाधमनी जननपिंड - mesonephros क्षेत्र भी शामिल है में एक साथ होता है. इन क्षेत्रों में भ्रूण में रक्त प्रणाली स्थापित करने में महत्वपूर्ण हैं और भ्रूण जिगर और फिर bonemarrow में वयस्क स्टेम सेल के विकास में स्टेम सेल की अंतिम आंदोलन के लिए होता है. जल्दी hematopoietic स्टेम कोशिकाओं प्रवाह cytometric छँटाई के द्वारा पीछा करने के लिए एक अधिक शुद्ध जनसंख्या प्राप्त भ्रूण के microdissection के माध्यम से इन अंगों से अलग किया जा सकता है. यह अस्पष्ट बनी हुई है कि इन स्टेम सेल आबादी भ्रूण और वयस्क स्टेम सेल पूल करने के लिए योगदान है. इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला की जांच कैसे जल्दी स्टेम कोशिकाओं कार्यात्मक भ्रूण और वयस्क hematopoietic स्टेम कोशिकाओं से अलग हैं. इसके अलावा, हमारी प्रयोगशाला hematopoietic स्टेम कोशिकाओं के विभिन्न आबादी के प्रकार और आनुवंशिक मॉडल की एक किस्म के संदर्भ में उनके कार्यात्मक भूमिका का परीक्षण. इस वीडियो में, हम विच्छेदन सूक्ष्म प्रक्रिया हम सामान्यतः का उपयोग करें और यह भी एक ठेठ FACS इन दुर्लभ आबादी के अलग plotfter के परिणाम दिखाने के प्रदर्शन, यह संभव है सहित कार्यात्मक assays के एक किस्म प्रदर्शन: कॉलोनी assays और अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण.

Protocol

विच्छेदन और जल्दी murine जर्दी थैली और क्षेत्र महाधमनी जननपिंड - mesonephros से hematopoietic स्टेम सेल का अलगाव

शुरू करने से पहले, यह महत्वपूर्ण है सभी अभिकर्मकों और उपकरण प्रक्रिया के लिए आवश्यक है:
- कैंची
- संदंश, 4, आकार, और शल्य चिकित्सा ग्रेड तुला इत्तला दे दी संदंश, 5 / 45 (वैकल्पिक) आकार
- सिरिंज के साथ 30 गेज सुई
- 35mm और 100mm पेट्री डिश
- पीबीएस 10% और 20% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ
- और अंत में Collagenase
विच्छेदन शुरू करने के लिए, हम 10.5 दिनों के बाद गर्भाधान में एक गर्भवती महिला के गर्भाशय सींग से फसल की जरूरत है.
पशु अनुमोदित प्रक्रियाओं के अनुसार euthanized हैं. हम कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था के बाद का उपयोग करें.
महिला के पेट इथेनॉल के साथ गीला है और त्वचा कैंची के साथ खोला है.
संदंश के साथ त्वचा होल्डिंग, अतिरिक्त कटौती पेरिटोनियम खोलने के बने होते हैं.
पेट खोला और गर्भाशय सींग visualized किया जा सकता है. संदंश का उपयोग करने के लिए गर्भाशय सींग पकड़, प्रत्येक बाहर का अंत और दोनों सींग आबकारी केंद्र में कटौती.
गर्भाशय सींग तो 10% FBS के साथ ठंड पीबीएस युक्त गर्भाशय के ऊतकों को हटाने के एक पेट्री डिश में रखा जाता है.
आकार 4 संदंश का प्रयोग और माइक्रोस्कोप के तहत काम कर रहे है, प्रत्येक भ्रूण conceptus के चारों ओर धीरे से एंडोमेट्रियल ऊतक को हटाने, नहीं नाल पंचर सावधान किया जा रहा है.
एक बार हटाया, भ्रूण ठंड पीबीएस और 10% FBS के साथ एक ताजा डिश में रखा जाता है.
ध्यान से अपरा ऊतक को दूर करने के लिए प्रकट भ्रूण संदंश का उपयोग भ्रूण के encased जर्दी थैली उनके मोड़ पर नाल से दूर कटौती की जर्दी थैली में encased है. जर्दी थैली vitelline धमनियों, और गर्भनाल के एक हिस्से से युक्त, धीरे से भ्रूण से किया जा सकता है दूर छेड़ा और पृथक्करण के लिए बर्फ पर अलग सेट.
भ्रूण 10% FBS साथ पीबीएस के न्यूनतम स्तर के साथ एक छोटे से पेट्री डिश में ले जाया जाता है - सिर्फ भ्रूण पर्याप्त गीला लेकिन बहुत ज्यादा नहीं. इष्टतम स्तर भ्रूण स्थिर रखना है, जबकि प्लेट धीरे उत्तेजित भ्रूण सुरक्षित विच्छेदन के दौरान जगह में रखते हुए.
30 गेज सुई है, जो forelimbs ऊपर और hindlimbs नीचे काटने से भ्रूण के ऊपरी और निचले भाग को हटाने के लिए उपयोग किया जाता है स्विच. काटने के उपकरणों के रूप में सुइयों का उपयोग कर के साथ परिचित बनने के कुछ अभ्यास ले सकते हैं. सुइयों पार करके दोहराया छोटे कटौती का उपयोग करने का एक तरीका है कि गैर प्रमुख हाथ में आयोजित किया जाता है सुई के लिए एक काटने गाइड के रूप में कार्य प्रमुख हाथ में आयोजित की सुई के साथ ऊतक, काटना होगा.
भ्रूण के पृष्ठीय भाग निकालें. यह ऊतक कि somites शामिल है. धीरे दूर ऊतक पृष्ठीय अधिकांश में कटौती, जबकि महाधमनी (लाल रेखा) किसी भी निक्स को रोकने से पर्याप्त दूरी शेष. महाधमनी काटना रक्त की हानि और आसानी से अपने स्थान कल्पना असमर्थता में नतीजा होगा. फिर, सुइयों के साथ छोटे कटौती करने के लिए एक सटीक काटने के स्थान को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है.
देखने के बाहर अतिरिक्त ऊतक दूर पुश और भ्रूण के चारों ओर मोड़ उदर ऊतक में कटौती, फिर महाधमनी के करीब के रूप में यह knicking के बिना संभव के रूप में काटने. कटौती बनाया इष्टतम स्थान से बहुत दूर पेट की वर्तमान जा रहा है ऊतकों, जो एक बार एजीएम अलग है हटाया जा सकता है पर नतीजा होगा.
अपने नीचे पृष्ठीय थाली के खिलाफ या अपनी पीठ की ओर से भ्रूण स्थिति. धीरे पक्षों नीचे धक्का और gonadal लकीरें के स्थान visualizing द्वारा खुले भ्रूण टेढ़ा. ये थोड़ा ऑफ सेंटर महाधमनी के दोनों तरफ ट्यूब संरचनाओं की तरह के रूप में स्थित हैं.
अतिरिक्त पक्ष के ऊतकों को हटाने से पहले के रूप में एक ही काटने तकनीकों का उपयोग करके विच्छेदन को पूरा करें. एक बार भ्रूण की ओर के ऊतकों को हटा दिया जाता है, तो भ्रूण उल्टा कर दिया है शेष पक्ष ऊतक निकालने.
इस बिंदु पर, एजीएम किसी भी अतिरिक्त ऊतक कि महाधमनी या gonads के लिए चोट के बिना सुइयों के साथ आसानी से हटाया जा सकता है के लिए निरीक्षण किया है. स्टेम सेल की आबादी के बाद से हम केवल शुद्धि के लिए कुछ कोशिका की सतह मार्करों पर भरोसा बेहतर अलगाव में संभव परिणाम के रूप में बहुत अधिक के रूप में हटाना.
तुला - इत्तला दे दी संदंश का प्रयोग, धीरे हदबंदी के लिए तैयार है जब तक प्रत्येक वार्षिक आम बैठक और ठंड पीबीएस में जगह स्कूप 10% FBS के साथ.

पृथक्करण और FACS विश्लेषण

ऊतक, पहली जगह जर्दी और अलग नलियों में थैलियों AGMs अलग कर देना करने के लिए.
गोली ऊतकों संक्षेप में स्पिन और 10% FBS साथ पीबीएस त्यागें.
पीबीएस में 0.25% collagenase में ऊतकों 20% FBS के साथ पर्याप्त रूप से ऊतकों को कवर करने के लिए पर्याप्त मात्रा के साथ Resuspend.
37 डिग्री पर ऊतकों को सेते हैं. AGMs जर्दी sacs लिए 35-40mins के लिए 25-30mins.
ऊष्मायन अंत में, धीरे ऊतकों विंदुक ऊपर और पृथक्करण के लिए नीचे एकल कक्ष निलंबन में.
अतिरिक्त पीबीएस WI के साथ ऊतकों धोवें 10% FBS, गोली कोशिकाओं और 10% FBS के साथ ताजा बाँझ पीबीएस में resuspend.
FACS विश्लेषण के लिए, कोशिकाओं निर्माता की सिफारिशों के अनुसार के दाग हैं. हम बी.डी. बायोसाइंसेज से FACSAria का उपयोग करने के लिए प्रवाह cytometry प्रदर्शन. भ्रूण कोशिकाओं के आकार और कमजोरी के कारण, छँटाई एपर्चर वयस्क hematopoietic कोशिकाओं, जो हम भी प्रयोगशाला में अध्ययन के लिए की तुलना में एक बड़ा व्यास के लिए निकाला जाता है. इसी तरह, दबाव कम से कम वयस्क hematopoietic कोशिकाओं द्वारा आवश्यक शर्तों निकाला जाता है. उदाहरण के लिए, FACSAria पर छँटाई, नोजल का आकार 100 microns और सॉर्ट दबाव 30 साई होगा होगा.
स्टेम सेल के विश्लेषण के लिए, ट्रिपल सकारात्मक मार्करों cKit, CD34, और CD41 व्यक्त कोशिकाओं को अलग कर रहे हैं और जर्दी थैली और डबल सकारात्मक (cKit, CD34) से हल FACS के माध्यम से वार्षिक आम बैठक से अलग कर रहे हैं. एक ठेठ साजिश इस तरह दिखेगा: cKit सकारात्मक कोशिकाओं CD34 और CD41 एक साथ या व्यक्तिगत के लिए विश्लेषण कर रहे हैं. आम तौर पर कोशिकाओं को स्टेम सेल सकारात्मक आबादी के एक सबसेट के रूप में पाया आबादी के साथ प्रत्येक मार्कर के लिए धनात्मकता की एक उन्नयन प्रदर्शित करते हैं. इन भूखंडों हमें पता चलता है कि हम जर्दी थैली और प्रति एजीएम प्रति 100-300 कोशिकाओं के साथ एक अच्छा सेल उपज हासिल किया है.

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