Isolering av tidiga hematopoetiska stamceller från Murine gulesäcken och årsstämma

Summary

Denna video visar hur man mikro-dissekera gulesäcken och aorta-gonad-mesonephros regionen från embryon och använda flödescytometri för att sortera hematopoetiska stamceller.

Abstract

I musen embryot, inträffar tidigt blodbildningen samtidigt i flera organ, vilket inkluderar gulesäcken och stora kroppspulsådern-gonad-mesonephros regionen. Dessa regioner är avgörande för att blodet systemet i embryon och leder till en eventuell förflyttning av stamceller i lever hos foster och utveckling av vuxna stamceller i bonemarrow. Tidig hematopoetiska stamceller kan isoleras från dessa organ genom microdissection av embryot följt av flödescytometrisk sortering för att få en mer ren befolkning. Det är fortfarande oklart hur dessa stamceller bidra till foster och vuxna stamceller pool. Dessutom undersöker vårt labb hur tidigt stamceller funktionellt skiljer sig från foster och vuxna hematopoetiska stamceller. Vidare vårt labb sorters olika populationer av hematopoetiska stamceller och testa deras funktionella roll i samband med en rad olika genetiska modeller. I den här videon visar vi mikro-dissektion förfarande vi vanligen använder och även visa resultatet av en typisk FACS plotfter isolera dessa sällsynta populationer, är det möjligt att utföra en rad olika funktionella analysmetoder inklusive: koloni analyser och benmärgstransplantation.

Protocol

Dissektion och isolering av tidiga hematopoetiska stamceller från murina gulesäcken och aorta-gonad-mesonephros regionen

1. Före start är det viktigt att ha alla reagenser och verktyg som behövs för förfarandet:
   
   • Saxar
   • Tång, storlek 4, och kirurgisk kvalitet böjd spets pincett, Storlek 5 / 45 (tillval)
   • 30 gauge nålar med spruta
   • 35mm och 100mm petriskålar
   • PBS med 10% och 20% fetalt bovint serum
   • och slutligen, kollagenas
2. För att börja dissektion måste vi skörda livmoder hornen från en gravid hona på 10,5 dagar efter befruktningen.
3. Djur avlivas i enlighet med godkända förfaranden. Vi använder oss av kvävning koldioxid, följt av halsdislokation.
4. Honans buk är våt av etanol och huden öppnas med sax.
5. Håll huden med pincett, finns ytterligare nedskärningar för att öppna bukhinnan.
6. Buken öppnas och livmodern hornen kan visualiseras. Använd pincett för att hålla livmodern horn, skär varje distala ände och i mitten av punktskatter båda hornen.
7. Uterin horn placeras sedan i en petriskål med kall PBS med 10% FBS att ta bort livmodern vävnader.
8. Använda storlek 4 pincett och arbetar under mikroskop, försiktigt bort endometrial vävnad från runt varje embryo Conceptus, försiktigt så att inte punktera moderkakan.
9. När bort, embryona placeras i en ny skål med kallt PBS och 10% FBS.
10. Ta försiktigt bort moderkakan vävnad för att avslöja embryot inneslutet i gulesäcken genom att använda pincett för att klippa embryo-inneslutet gulesäcken borta från moderkakan vid deras tidpunkt. Gulesäcken med vitelline artärer, och en del av navelsträngen, kan lätt retade bort från embryot och ställ åt sidan på is för dissociation.
11. Embryot är flyttade till en liten petriskål med minimala nivåer av PBS med 10% FBS - precis tillräckligt för att blöta embryot, men inte för mycket. Optimala nivåer behålla embryot stilla medan plattan är långsamt upprörd, hålla embryot säkert på plats under dissektion.
12. Växla till 30 gauge nålar, som används för att ta bort den övre och nedre delar av embryot genom att klippa ovanför frambenen och under bakben. Att bli bekant med hjälp av nålar som skär instrument kan ta lite övning. En metod för att med hjälp av upprepade små skärsår genom att korsa nålar kommer att dissekera vävnaden, med nålen hålls i den dominerande handen för att fungera som en klippa guide för nål som hålls i den icke-dominanta handen.
13. Ta rygg delen av embryot. Detta är den vävnad som innehåller somites. Försiktigt skära bort rygg-mest vävnaden samtidigt som den är ett tillräckligt avstånd från aorta (röd linje) för att förhindra Knicks. Kapning aortan skulle resultera i förlust av blod och oförmågan att enkelt visualisera sitt läge. Återigen, göra små snitt med nålar är viktigt att upprätthålla en exakt kapning plats.
14. Tryck extra vävnad bort utom synhåll och vrid embryot runt för att klippa den ventrala vävnaden, återigen skära så nära aorta som möjligt utan knicking det. Nedskärningar för långt från den optimala placeringen skulle resultera i buken vävnader vara närvarande, som kan avlägsnas när stämman är isolerad.
15. Placera embryot med ryggsidan ner eller ryggen mot plattan. Försiktigt splay embryot öppna genom att trycka sidorna ner och visualisera placeringen av gonadal åsar. Dessa är placerade lite off-center som rör-liknande strukturer på vardera sidan av stora kroppspulsådern.
16. Fyll i dissektion genom att ta bort överskottet sidan vävnader med samma skärande tekniker som tidigare. När sidan vävnad av embryot tas bort, då embryot vänds upp och ner för att ta bort de kvarvarande sidan vävnad.
17. Vid denna punkt är årsstämman inspekteras för eventuell överflödig vävnad som kan avlägsnas enkelt med nålar utan skada på kroppspulsådern eller gonaderna. Ta bort så mycket överskott som möjligt ger bättre isolering av stamceller befolkningen eftersom vi är beroende av ett fåtal markörer cellens yta för rening.
18. Med hjälp av böjda spets pincett, försiktigt skopa upp varje årsstämma och lägg i kallt PBS med 10% FBS tills för dissociation.

Dissociation och FACS analys

1. Att skilja vävnaden, först säckar plats äggula och årsstämmor i separata rör.
2. Spin kort till pellets vävnader och kasta PBS med 10% FBS.
3. Resuspendera vävnader i 0,25% kollagenas i PBS med 20% FBS, med tillräckligt med volym för att tillräckligt täcker vävnader.
4. Inkubera i vävnaderna vid 37 grader. 25-30 minuter för bolagsstämmor och 35-40mins för gula säckar.
5. I slutet av inkubationen försiktigt pipettera vävnader upp och ner till avståndstagande till enstaka cellsuspensioner.
6. Tvätta vävnader med överskott PBS with 10% FBS, pellets cellerna och återsuspendera i färsk steril PBS med 10% FBS.
7. För FACS analys celler färgas enligt tillverkarens rekommendationer. Vi använder en FACSAria från BD Biosciences att utföra flödescytometri. På grund av storleken och bräcklighet på embryonala celler, är sorteringen bländaren justeras för en större diameter än för vuxna hematopoetiska celler, som vi också att studera i labbet. Likaså är trycket justeras till vara mindre än de villkor som krävs av vuxna hematopoetiska celler. Till exempel sortera på FACSAria skulle munstycket storlek vara 100 mikrometer och sortera trycket skulle vara 30 psi.
8. För analyser stamceller, är trippel positiva celler som uttrycker markörer cKit, CD34 och CD41 isolerade och sorteras från gulesäcken och dubbla positiv (cKit, CD34) är isolerade från årsstämman via FACS. En typisk tomten skulle se ut så här: cKit positiva celler analyseras för CD34 och CD41 samtidigt eller individuellt. Vanligtvis celler visar en gradering av positivitet för respektive markör med stamceller befolkningen finns som en delmängd av de positiva befolkningen. Dessa tomter visar oss att vi har uppnått en bra cell avkastning med 100-300 celler per gulesäcken och per årsstämman.