Isolierung von Anfang hämatopoetischen Stammzellen aus Murine Dottersack und AGM

Summary

Dieses Video zeigt, wie Mikro-sezieren den Dottersack und Aorta-Gonaden-Mesonephros Region aus Embryonen und die Verwendung der Durchflusszytometrie, um hämatopoetische Stammzellen zu sortieren.

Abstract

In der Maus-Embryo, tritt frühen Hämatopoese gleichzeitig in mehreren Organen, die den Dottersack und Aorta-Gonaden-Mesonephros Region umfasst. Diese Regionen sind entscheidend bei der Festlegung der Blutkreislauf in die Embryonen und führt zu den eventuellen Bewegung von Stammzellen in der fetalen Leber und dann die Entwicklung von adulten Stammzellen in der bonemarrow. Frühe hämatopoetischen Stammzellen können aus diesen Organen durch Mikrodissektion des Embryos durch durchflusszytometrische Sortierung gefolgt, um eine reine Population zu erhalten, isoliert werden. Es bleibt unklar, wie diese Stammzell-Populationen der fetalen und adulten Stammzellen-Pool beitragen. Auch untersucht unser Labor, wie früh Stammzellen funktionell unterscheiden sich von fetalen und adulten hämatopoetischen Stammzellen. Außerdem testen unsere Labor möglichen verschiedenen Populationen von hämatopoetischen Stammzellen und deren funktionelle Rolle im Kontext einer Vielzahl von genetischen Modellen. In diesem Video haben wir die Mikro-Dissektion Verfahren, das wir verwenden häufig und zeigen auch die Ergebnisse eines typischen FACS plotfter Isolierung dieser seltenen Populationen zeigen, ist es möglich, eine Vielzahl von funktionellen Assays darunter: Kolonie-Assays und Knochenmarktransplantationen.

Protocol

Dissection und Isolierung von frühen hämatopoetischen Stammzellen aus der Maus Dottersack und Aorta-Gonaden-Mesonephros Region

1. Bevor Sie beginnen, ist es wichtig, alle Reagenzien und Instrumenten für die das Verfahren haben:
   
   • Schere
   • Zange, Größe 4 und chirurgische grade gebogen Spitze Pinzette, Größe 5 / 45 (optional)
   • 30-Gauge-Nadel mit der Spritze
   • 35mm und 100mm Petrischalen
   • PBS mit 10% und 20% fötalem Rinderserum
   • und schließlich, Collagenase
2. Zu Beginn der Dissektion, müssen wir die Uterushörner von einer schwangeren Frau auf 10,5 Tage post Konzeption Ernte.
3. Die Tiere sind gemäß den vereinbarten Verfahren eingeschläfert. Wir verwenden Kohlendioxid Ersticken, durch Genickbruch folgte.
4. Die weiblichen Bauch ist nass mit Ethanol und die Haut wird mit einer Schere geöffnet.
5. Halten Sie die Haut mit einer Pinzette, sind weitere Kürzungen vorgenommen, um das Peritoneum zu eröffnen.
6. Der Bauch wird geöffnet und der Uterushörner visualisiert werden können. Mit einer Pinzette die Uterushörner halten, schneiden Sie jeden distalen Ende und der Mitte der Verbrauchsteuer beiden Hörner.
7. Uterushörner werden dann in eine Petrischale mit kaltem PBS mit 10% FBS auf uterine Gewebe zu entfernen platziert.
8. Mit Größe 4 Zangen und Arbeiten unter dem Mikroskop, entfernen Sie vorsichtig das Endometrium aus um jeden Embryo conceptus, darauf achtend, nicht Punktion der Plazenta.
9. Nach dem Herausnehmen werden die Embryonen in einer frischen Schüssel mit kaltem PBS und 10% FBS platziert.
10. Entfernen Sie vorsichtig das Plazentagewebe zu offenbaren, den Embryo umhüllt den Dottersack mit der Pinzette auf den Embryo-ummantelt Dottersack weg von der Plazenta bei ihrer Stelle geschnitten. Der Dottersack enthält vitelline Arterien, und ein Teil der Nabelschnur, kann sanft gehänselt werden vom Embryo und beiseite stellen auf Eis Dissoziation.
11. Der Embryo wird zu einer kleinen Petrischale mit minimalem Niveau von PBS mit 10% FBS bewegt - gerade genug, um den Embryo nass, aber nicht zu viel. Optimal Niveau zu halten den Embryo stationär, während die Platte langsam bewegt wird, hält der Embryo sicher an seinem Platz beim Präparieren.
12. Wechseln Sie auf die 30-Gauge-Nadeln, mit denen die oberen und unteren Teilen des Embryos, indem oberhalb der Vorderbeine und unterhalb der hinteren Gliedmaßen zu entfernen sind. Kennenlernen mit den Nadeln als schneidenden Instrumenten kann einige Übung. Ein Verfahren zur Verwendung wiederholt kleine Schnitte durch Kreuzung der Nadeln wird sezieren das Gewebe mit der Nadel in die dominante Hand als Schnittführung für die Nadel, die in der nicht-dominanten Hand gehalten wird, zu handeln.
13. Entfernen Sie den hinteren Teil des Embryos. Dies ist das Gewebe, das die Somiten enthält. Vorsichtig wegschneiden dorsal-die meisten Gewebe, während verbleibenden einen ausreichenden Abstand von der Aorta (rote Linie) auf einen Knicks zu verhindern. Schneiden der Aorta würde in den Blutverlust und die Unfähigkeit, einfach visualisieren seiner Lage führen. Auch hier macht kleine Schnitte mit den Nadeln ist wichtig für die Erhaltung einer präzisen Schneiden Lage.
14. Drücken Sie die zusätzlichen Gewebe entfernt aus der Sicht und drehen Sie den Embryo in der ventralen Gewebe geschnitten, wieder Schnitt möglichst nahe an der Aorta wie möglich, ohne knicking es. Cuts gemacht zu weit von der optimalen Lage wäre in Bauch-Gewebe vorhanden, die entfernt werden, sobald die Hauptversammlung ist isoliert werden können führen.
15. Position der Embryo mit seiner dorsalen Seite nach unten oder dem Rücken gegen die Platte. Gently splay des Embryos öffnen, indem Sie die Seiten nach unten und Visualisierung der Lage der Gonaden Grate. Diese sind leicht aus der Mitte, wie Rohr-ähnliche Strukturen auf beiden Seiten der Aorta befindet.
16. Füllen Sie die Dissektion durch das Entfernen der überschüssigen Seite Geweben unter Verwendung der gleichen Schnitt-Techniken wie zuvor. Sobald die Seite Gewebe des Embryos entfernt wird, dann wird der Embryo auf den Kopf, um die restlichen Seiten Gewebe zu entfernen eingeschaltet.
17. An diesem Punkt ist die Hauptversammlung für überschüssiges Gewebe, das leicht mit den Nadeln ohne Verletzung der Aorta oder Keimdrüsen entfernt werden inspiziert. Entfernen so viel wie möglich über Ergebnisse in eine bessere Isolierung der Stammzellen Bevölkerung, da wir nur auf ein paar Zelloberflächenmarker für die Reinigung zu verlassen.
18. Mit der gebogenen Spitze Pinzette vorsichtig schöpfen jeder Hauptversammlung und in kaltem PBS mit 10% FBS, bis sie zur Dissoziation.

Dissoziation und FACS-Analyse

1. Um distanzieren dem Gewebe, den ersten Platz Dottersäcke und Hauptversammlungen in getrennten Röhren.
2. Spin kurz Pellet Geweben und entsorgen PBS mit 10% FBS.
3. Resuspendieren Gewebe in 0,25% Kollagenase in PBS mit 20% FBS, mit genügend Volumen, um angemessen abdecken Gewebe.
4. Inkubieren des Gewebes bei 37 Grad. 25-30min für Hauptversammlungen und 35-40min für Dottersäcke.
5. Am Ende der Inkubationszeit, sanft Pipette Gewebe nach oben und unten, um die Dissoziation in einzelne Zell-Suspensionen.
6. Waschen Sie die Gewebe mit einem Überschuss an PBS with 10% FBS, Pellet der Zellen und Resuspension in frischem sterilem PBS mit 10% FBS.
7. Für FACS-Analyse werden die Zellen nach den Empfehlungen des Herstellers gefärbt. Wir verwenden eine FACSAria von BD Biosciences auf der Durchflusszytometrie durchgeführt. Aufgrund der Größe und Fragilität der embryonalen Zellen, wird die Sortierung Öffnung für einen größeren Durchmesser als bei Erwachsenen hämatopoetischen Zellen, die wir auch im Labor-Studie angepasst. Ebenso wird der Druck so eingestellt, daß weniger als die Bedingungen in der Erwachsenenbildung hämatopoetischen Zellen erforderlich. Zum Beispiel, Sortierung auf dem FACSAria, würde die Düsengröße 100 Mikrometer und die Art Druck 30 psi werden würde.
8. Für Stammzell-Analysen-, Dreibett-positive Zellen, die Marker CKIT, CD34, CD41 und werden isoliert und sortiert aus dem Dottersack und doppelt positiven (CKIT, CD34) sind von der Hauptversammlung via FACS isoliert. Ein typisches Grundstück würde wie folgt aussehen: CKIT positive Zellen sind für CD34 und CD41 gleichzeitig oder einzeln analysiert. Normalerweise Zellen zeigen eine Abstufung der Positivität für jeden Marker mit der Stammzell-Population als eine Teilmenge der positiven Populationen gefunden. Diese Diagramme zeigen uns, dass wir eine gute Zellausbeute mit 100-300 Zellen pro Dottersack und pro AGM erreicht.