Biology

Murin Yolk Sac ve AGM Erken Hematopoetik Kök Hücre İzolasyonu

Published: June 27, 2008 doi: 10.3791/789

Kelly Morgan¹, Michael Kharas¹, Elaine Dzierzak², D. Gary Gilliland^1,3

¹Department of Hematology and Oncology, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School, ²Department of Cell Biology and Genetics, Erasmus University Medical Center, ³Department of Medicine, Howard Hughes Medical Institute, Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School

Summary

Bu video yolk kesesi ve aort-gonad mesonephros bölge embriyolardan mikro incelemek ve hematopoietik kök hücreler sıralamak için flow sitometri kullanmak nasıl gösterir.

Abstract

Fare embriyo, erken hematopoez yolk kesesi ve aort-gonad-mesonephros bölge içeren birden fazla organlar, aynı anda oluşur. Bu bölgeler embriyoların kan sisteminin kurulması çok önemlidir ve fetal karaciğer bonemarrow yetişkin kök hücrelerin gelişmesi ve daha sonra kök hücrelerin nihai hareketi sağlar. Erken hematopoietik kök hücreler, bu organların akım sitometrik sıralayarak daha saf bir nüfusa elde etmek için embriyonun mikrodiseksiyon yoluyla izole edilebilir. Bu kök hücre popülasyonlarının fetal ve yetişkin kök hücre havuzu nasıl katkıda belirsizliğini koruyor. Ayrıca, laboratuvar erken kök hücreler işlevsel, fetal ve yetişkin hematopoetik kök hücreler nasıl farklı inceler. Ayrıca, laboratuvar türlü hematopoietik kök hücrelerin farklı popülasyonlar ve çeşitli genetik modelleri bağlamında işlevsel rolü test. Koloni testleri ve kemik iliği nakli: Bu videoda, biz, sık kullandığınız ve aynı zamanda bu nadir nüfusun izole tipik bir FACS plotfter sonuçlarını göstermek mikro diseksiyon prosedürü göstermektedir, fonksiyonel testlerinin de dahil olmak üzere çeşitli gerçekleştirmek mümkündür.

Protocol

Diseksiyon ve izolasyon fare yolk kesesi ve aort-gonad-mesonephros bölgenin erken hematopoetik kök hücrelerin

Başlamadan önce, prosedürü için gerekli tüm reaktifler ve araçlar için önemlidir:
- Makas
- Forseps, büyüklüğü 4 ve cerrahi sınıf kıvrık uçlu forseps, büyüklüğü 5 / 45 (isteğe bağlı)
- Şırınga ile 30 insülin iğnesi
- 35mm ve 100mm Petri kapları
- PBS% 10 ve% 20 fetal sığır serumu
- ve son olarak, kollajenaz
Diseksiyonu başlamak için, biz yazılan anlayışı 10.5 gün hamile bir kadın rahim boynuzları hasat gerekir.
Hayvanlar onaylanmış prosedürlere göre ötenazi. Biz, karbon dioksit boğulma, servikal dislokasyon kullanın.
Kadın karnı etanol ile ıslak ve cilt makas açıldı.
Forseps ile cilde Holding, periton ek kesikler açmak için yapılır.
Karın açılır ve rahim boynuzları görüntülenebilmekte. Uterin boynuz tutmak için forseps kullanarak, her distal uç ve iki boynuz tüketim merkezi kesti.
Uterus boynuzları sonra rahim dokuları temizlemek için% 10 FBS ile soğuk PBS içeren bir Petri kabındaki yerleştirilir.
Boyutu 4 forseps kullanarak ve mikroskop altında çalışan, yavaşça plasenta ponksiyon dikkatli olmak, her embriyo konseptus etrafında endometrial doku kaldırmak.
Kaldırılır sonra, embriyolar soğuk PBS ve% 10 FBS ile taze bir tabak içinde yerleştirilir.
Plasental doku embriyonun kendi noktada plasenta uzak embriyo kaplı yolk sac kesmek için forseps kullanarak yolk sac kaplı ortaya çıkarmak için dikkatlice çıkarın. Vitellin arterler, ve göbek kordonu bir kısmını içeren yolk kesesi embriyo hafifçe uzak alay ve disosiasyon için buz üzerinde bir kenara olabilir.
Embriyo% 10 FBS PBS minimal düzeyde küçük bir Petri kabı taşınır yeterli embriyo ıslak ama çok fazla değil. Plaka Diseksiyon sırasında yavaş yavaş, güvenli bir şekilde embriyo tutmak, ajite ise optimal düzeyde embriyo sabit tutmak.
Ön ayakları üstünde ve arka ayaklarının altında kesim tarafından embriyonun alt ve üst kısımları kaldırmak için kullanılan 30 gauge iğne, geçin. Kesme aletleri gibi iğneler kullanarak aşina olmak biraz pratik sürebilir. Iğneler geçerek tekrarlanan küçük kesimler kullanarak bir yöntem, baskın yapılan iğne baskın olmayan elle tutulur bir kesim kılavuzu olarak hareket etmek bir iğne ile doku disseke.
Embriyonun dorsal kısmını çıkarın. Bu Somitlerin içeren bir dokudur. Aorta (kırmızı çizgi) herhangi bir Knicks önlemek için yeterli bir mesafe kalarak en dorsal doku yavaşça kesip. Kesme aort, kan kaybı ve kolayca yerini görselleştirmek için yetersizlik neden olacaktır. Yine iğne ile küçük kesikler hassas kesim yeri korumak için hayati önem taşımaktadır.
Uzak görünümü dışında ekstra doku itin ve tekrar knicking olmadan, mümkün olduğunca aort yakın olarak kesme, ventral doku kesmek için embriyo turn around. Keser, en uygun yerden çok uzakta AGM izole bir kez silinebilir mevcut olan karın dokuları, neden olacaktır.
Embriyonun plaka karşı aşağı dorsal tarafına veya arkasına yerleştirin. Hafifçe yanlardan aşağı iterek ve gonadal sırtlar yer görselleştirme açık embriyo Şevli. Bunlar aortanın her iki tarafta tüp benzeri yapılar olarak off-center biraz bulunmaktadır.
Daha önce olduğu gibi aynı kesim teknikleri kullanarak, aşırı yan dokuları kaldırarak diseksiyonu tamamlayın. Embriyo yan dokusu çıkarıldıktan sonra, daha sonra embriyo kalan yan doku çıkarmak için baş aşağı açıktır.
Bu noktada, AGM, aort ya da gonadlar yaralanma olmadan iğne ile kolayca çıkarılabilecek olan herhangi bir aşırı doku denetlenir. Arıtma için sadece birkaç hücre yüzey belirteçleri güveniyor beri kök hücre popülasyonu daha iyi izolasyon olası sonuç olarak çok daha fazla olarak kaldırılıyor.
Kıvrık uçlu forseps kullanarak, yavaşça disosiasyon için hazır olana kadar soğuk PBS içinde% 10 FBS ile her AGM ve yer kadar kepçe.

Bölünmeler ve FACS Analizi

Ayrı tüplerde doku, ilk etapta sarısı keseler ve AGMs ayırmak.
Pelet dokular kısaca Spin ve% 10 FBS ile PBS atın.
Dokuların yeterince karşılamak için yeterli hacmi ile,% 20 FBS PBS içinde% 0.25 kollajenaz doku tekrar
37 derece dokuların inkübe edin. 25-30 dakika, yumurta sarısı keseler AGMs ve 35-40mins.
Inkübasyon sonunda, dokular hafifçe yukarı pipet ve tek hücre süspansiyonları aşağı disosiasyon.
Dokuların aşırı PBS wi yıkayınth% 10 FBS, pelet% 10 FBS ile taze steril PBS içinde hücre ve tekrar süspansiyon haline getirin.
FACS analizi için, hücreler üreticinin tavsiyelerine göre lekeli. Biz flow sitometri gerçekleştirmek için BD Biosciences bir FACSAria kullanın. Embriyonik hücreler boyutu ve kırılganlık nedeniyle, sıralama diyafram, biz de laboratuvarda çalışma, yetişkin hematopoetik hücreler daha büyük bir çap için ayarlanır. Aynı şekilde, basınç yetişkin hematopoetik hücreler tarafından gerekli koşulları daha az olacak şekilde ayarlanır. Örneğin, FACSAria sıralama, meme büyüklüğü 100 mikron ve sıralama basıncı 30 psi olacaktır olacaktır.
Belirteçlerinin cKit, CD34 ve CD41 ifade üçlü pozitif hücrelerin kök hücre analizleri için, izole edilir ve yumurta sarısı kesesi ve çift pozitif (cKit, CD34) sıralanmış FACS üzerinden AGM izole edilmiştir. Tipik bir komplo bu gibi görünecektir: cKit pozitif hücreler CD34 ve CD41 aynı anda veya tek tek analiz edilir. Genellikle hücreler pozitif popülasyonlarının bir alt kümesi olarak bulunan kök hücre nüfusu ile her bir belirteç için pozitif bir tonlama gösterir. Bu araziler ortalama 100-300 hücreleri yolk kesesi ve başına AGM ile iyi bir hücre verimi elde etmiş olduğunu bize göstermektedir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.