Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Moleculaire evolutie van de Tre recombinase

Published: May 29, 2008 doi: 10.3791/791

Summary

Hier het verslag van de generatie van Tre recombinase door middel van gerichte, moleculaire evolutie. Tre recombinase herkent een vooraf gedefinieerde doelsequentie binnen het LTR-sequenties van het HIV-1 provirus, resulterend in de excisie en uitroeiing van de provirus van geïnfecteerde menselijke cellen. Terwijl het nog in de kinderschoenen staat, zal de gerichte moleculaire evolutie kan de creatie van aangepaste enzymen die zal dienen als instrument van de moleculaire chirurgie en moleculaire geneeskunde.

Abstract

Hier het verslag van de generatie van Tre recombinase door middel van gerichte, moleculaire evolutie. Tre recombinase herkent een vooraf gedefinieerde doelsequentie binnen het LTR-sequenties van het HIV-1 provirus, resulterend in de excisie en uitroeiing van de provirus van geïnfecteerde menselijke cellen.

We zijn begonnen met Cre, een 38-kDa recombinase, dat een 34-bp double-stranded DNA-sequentie bekend als loxP herkent. Omdat Cre kan effectief elimineren genomische sequenties hebben we besloten om op maat een recombinase dat de sequentie tussen de 5'-en 3'-LTR LTR van een geïntegreerde HIV-1 provirus kon verwijderen. Als eerste stap die we geïdentificeerd sequenties in de LTR sites die vergelijkbaar waren met loxP en getest voor recombinatie activiteit. Aanvankelijk Cre en gemutageniseerd Cre bibliotheken niet aan de gekozen loxLTR sites van de HIV-1 provirus recombineren. Als het begin van een gerichte moleculaire evolutie-proces vereist ten minste restactiviteit, werden de oorspronkelijke asymmetrische loxLTR sequenties te splitsen in subgroepen en opnieuw worden getest voor recombinatie activiteit. Optreden als tussenproducten, was recombinatie activiteit getoond met de subsets. Vervolgens recombinase bibliotheken werden verrijkt door herhalend evolutie cycli. Vervolgens werden verrijkt bibliotheken geschud en opnieuw gecombineerd. De combinatie van verschillende mutaties bleek synergetische en recombinases werden gecreëerd die in staat waren om loxLTR1 en loxLTR2 recombineren. Dit was het bewijs dat een evolutionaire strategie door middel van tussenproducten succesvol kan zijn. Na een totaal van 126 cycli evolutie individuele recombinases waren functioneel en structureel geanalyseerd. De meest actieve recombinase - Tre - had 19 aminozuur veranderingen ten opzichte van Cre. Tre recombinase was in staat om accijnzen van de HIV-1 provirus van het genoom HIV-1 geïnfecteerde HeLa cellen (zie "HIV-1 proviraal DNA Excisie Met behulp van een Evolved recombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-Instituut voor Experimentele Virologie en Immunologie, Hamburg, Duitsland). Terwijl het nog in de kinderschoenen staat, zal de gerichte moleculaire evolutie kan de creatie van aangepaste enzymen die zullen dienen als instrumenten van "moleculaire chirurgie" en moleculaire geneeskunde.

Tags

Celbiologie HIV-1 Tre recombinase Site-specifieke recombinatie moleculaire evolutie
Moleculaire evolutie van de Tre recombinase
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Buchholz, F. Molecular Evolution ofMore

Buchholz, F. Molecular Evolution of the Tre Recombinase. J. Vis. Exp. (15), e791, doi:10.3791/791 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter