Summary
Här rapporterar vi generationen av Tre recombinase genom riktade, molekylär evolution. Tre recombinase känner igen en på förhand definierad målgrupp sekvens inom LTR sekvenser av HIV-1 provirussekvenser, vilket resulterar i excision och utrotning av provirussekvenser från infekterade mänskliga celler. Medan han fortfarande i sin linda, kommer riktad molekylär evolution möjliggöra skapandet av anpassade enzymer som kommer att fungera som verktyg för molekylär kirurgi och molekylär medicin.
Abstract
Här rapporterar vi generationen av Tre recombinase genom riktade, molekylär evolution. Tre recombinase känner igen en på förhand definierad målgrupp sekvens inom LTR sekvenser av HIV-1 provirussekvenser, vilket resulterar i excision och utrotning av provirussekvenser från infekterade mänskliga celler.
Vi började med CRE, en 38-kDa recombinase, som erkänner en 34-bp dubbelsträngat DNA-sekvens som kallas loxP. Eftersom Cre effektivt kan eliminera genomiska sekvenser, satte vi ut för att skräddarsy en recombinase som kunde ta bort sekvensen mellan 5'-LTR och 3'-LTR av ett integrerat HIV-1 provirussekvenser. Som ett första steg har vi identifierat sekvenser inom LTR webbplatser som liknade loxP och testas för rekombination aktivitet. Inledningsvis Cre och mutagenized Cre biblioteken misslyckats med att kombinera det valda loxLTR platser i HIV-1 provirussekvenser. Som början på något riktad molekylär evolution processen kräver minst restaktiviteten var de ursprungliga asymmetriska loxLTR sekvenser delas in i undergrupper och testas igen för rekombination aktivitet. Agerar som intermediärer, var rekombination aktivitet visas med delmängder. Därefter recombinase biblioteken var berikas genom UPPREPANDE evolutionen cykler. Därefter berikades bibliotek blandas och modifierat. Kombinationen av olika mutationer visade synergieffekter och recombinases skapades som kunde kombinera loxLTR1 och loxLTR2. Detta var bevis för att en evolutionär strategi genom intermediärer kan vara framgångsrika. Efter totalt 126 evolutionen cykler enskilda recombinases var funktionellt och strukturellt analyseras. De mest aktiva recombinase - Tre - hade 19 aminosyra förändringar i förhållande till Cre. Tre recombinase kunde punktskatter HIV-1 provirussekvenser från genomet HIV-1 infekterade HeLa celler (se "hiv-1 proviral DNA Excision Använda en Evolved Recombinase", Hauber J., Heinrich-Pette-institutet för experimentell virologi och immunologi, Hamburg, Tyskland). Medan han fortfarande i sin linda, kommer riktad molekylär evolution möjliggöra skapandet av anpassade enzymer som kommer att fungera som verktyg för "molekylär kirurgi" och molekylär medicin.
