תיוג מדרדר לתאי הגנגליון של הרשתית על ידי יישום של זהב Fluoro על פני השטח של Colliculus מעולה

Summary

וידאו זה מתאר את שיטת תיוג מדרדר של RGC ידי יישום fluoro זהב (FG) על פני השטח של מעולה colliculus (SC). טכניקה מערבת קידוח בגולגולת, aspirating קליפת המוח, וליישם ספוג ג'לטין על פני כל הגב של SC.

Abstract

גנגליון רשתית תא (RGC) ספירת חיונית כדי להעריך את ניוון הרשתית במיוחד גלאוקומה. אמין תיוג RGC חיונית להערכת ההשפעות של טיפול כלשהו. בשנת החולדה, על 98% RGCs ידוע הפרויקט colliculus מעולה הנגדי (SC) (פורסטר פיטרס, 1967). יישום fluoro זהב (FG) על פני השטח של SC יכול תווית כמעט כל RGCs, כך שנוכל להתמקד נוירון זה ברשתית הפגיעים ביותר גלאוקומה. FG הוא נלקח על ידי מסופי האקסון של תאים הגנגליון ברשתית והעבירו בילטרלי retrogradely כדי somas שלה ברשתית. השווה עם תיוג מדרדר של RGC ידי הצבת FG בגדם של עצב הראייה transected עבור 2 ימים, התערבות של הישרדות RGC ממוזער. השווה עם כתמים סגולים cresyl כי כתמי RGCs, תאים amacrine ו האנדותל של כלי הדם שכבת הגנגליון ברשתית התא, בשיטה זו תיוג הוא ספציפי יותר RGC. וידאו זה מתאר את שיטת תיוג מדרדר של RGC ידי יישום FG על פני השטח של SC. ניתוחים כוללים קידוח בגולגולת; aspirating קליפת לחשוף את SC ויישום ספוג ג'לטין על פני כל הגב של SC מוצגים. עצות שימושיות למניעת דימום תוך גולגולתי השאיפה מסיבי של SC קיבלו.

Protocol

1. לטשטש את העכברוש בזריקה תוך הצפק של קטמין (80mg/kg) ו xylazine (8mg/kg) (יחס נפח ב 02:01). החל משחה סטרילית סיכה העין כדי למנוע התייבשות של הקרניות במהלך הניתוח.
2. לגלח את הראש פרווה (מן העין לרמה האוזן) ותקן ראש בראש על הבמה על ידי ראש מהדק ולהגדיר החותכות שלו בסרגל החותכת.
3. האזור ולחטא את הפעולה עם פתרון של 10% povidone יוד ואחריו אלכוהול 70%.
4. חותכים את העור ואת שרירי לחשוף את התפרים הגולגולת (sagittal, התפרים העטרה ואת רוחבי) (איור 1). החל משכך כאבים, bupivicaine ככתם לאזור החתך (שלא יעלה על 2 מ"ג / ק"ג).
5. לקדוח חור בגולגולת (O 2x2 מ"מ, 0.5 מ"מ משני התפרים sagittal ו רוחבי) בכל צד של תפר sagittal. הימנע קרע של קרומי המוח ואת סינוס שוכב מתחת התפרים.
   
   
   באיור 1. סימני ההיכר בגולגולת חולדה חיה.
   
   
6. גזור לפתוח את קרומי המוח על ידי מספריים האביב, למנוע קריעה.
7. לשאוב את התוכן מוחין שנמצאת מעל פני השטח הגבי של colliculus מעולה בקפידה על ידי משאבת ואקום ושלושה לבדוק נקודות ניתן לצפות:
   1. את הצבע של רקמת המוח שינויים מאפור לאפור
   2. להפסיק aspirating כאשר נוזל חסר צבע השדרה לצאת
   3. בזהירות להגדיל את הרמה הנמוכה ביותר שאיבה אופקית לחשוף את colliculus מעולה צהבהב מכוסה על ידי דורה
8. לשאוב את התוכן המוח על SC עד ארבע הקצוות של SC ניתן לצפות ישירות תחת מיקרוסקופ. החלק של קליפת המוח הסיר צריך להישמר עד למינימום כדי למנוע תופעות לוואי לא רצויות (למשל, חוסר תפקוד המנוע). היזהר שלא לגעת בסינוסים.
9. ספוג את הנוזל בתוך החור עם פס דק כותנה סטרילי כדי להפוך את פני השטח של SC כמו יבש ככל האפשר. ואז, במקום שכבה דקה של ספוג הג'לטין מראש ספוגה זהב Fluoro 6% על פני השטח של SC (FG הוא נלקח על ידי מסופי האקסון של תאים הגנגליון ברשתית והעבירו בילטרלי retrogradely כדי somas שלה ברשתית).
10. ממלאים את החור עם gelfoam ולסגור את הפצע העור עם קליפים תפר.
11. החיות הורשו להתאושש תחת מנורת ליבון כדי להתחמם. משככי כאבים, עצירות (100mcg/kg), מוחל דרך הפה במשך 5 ימים לאחר תיוג SC במי השתייה.

Discussion

1. למה להשתמש בשיטה כירורגית עבור לספור הגנגליון ברשתית התא?
   
   ב עכברוש על 98% מכלל התאים הגנגליון ברשתית (RGC) ידועים הפרויקט colliculus מעולה הנגדי (SC). יישום fluoro זהב על פני השטח של SC יכול תווית כמעט כל RGCs, כך אנחנו יכולים להתמקד נוירון זה ברשתית הפגיעים ביותר גלאוקומה. השווה עם תיוג מדרדר של RGC ידי הצבת FG בגדם של עצב הראייה transected עבור 2 ימים, התערבות של הישרדות RGC ממוזער. השווה עם כתמים סגולים cresyl כי כתמי התא amacrine, RGC ותא endothelia של כלי הדם שכבת הגנגליון ברשתית התא, שיטה זו היא ספציפית יותר RGC.
   
   
2. כיצד למנוע דימום מוגזם?
   
   ראשית, ודא עכברוש הוא מורדם כראוי על ידי בדיקת טונוס שרירים ואת רפלקס הקרנית. הרדמה מספקת יגרום לדימום רב. שנית, למנוע פעולות שיפגעו הסינוס כגון קידוח קרוב מדי תפר או קריעה של קרומי המוח לתוך הקיר בסינוסים. שלישית, להיות זהיר כדי לשמור על הדורה שוכב על שטחי שלם SC במיוחד באזור האף.
   
   
3. כמה זמן לוקח עד RGCs מסומנים?
   
   ארבעה ימים לאחר תיוג SC, RGC יכול להיות מתויג. אני בדרך כלל להמתין שבעה ימים לקבלת תוצאות טובות יותר.