Etichettatura retrograda di cellule gangliari della retina mediante l'applicazione di fluoro-oro sulla superficie del collicolo superiore

Summary

Questo video descrive il metodo di marcatura retrograda di RGC mediante l'applicazione di fluoro-oro (FG) sulla superficie del collicolo superiore (SC). Tecnica consiste nel forare il cranio, aspirando la corteccia, e l'applicazione di spugna di gelatina su tutta la superficie dorsale del SC.

Abstract

Cellule gangliari della retina (RGC) conteggio è essenziale per valutare la degenerazione retinica soprattutto nel glaucoma. Etichettatura affidabile RGC è fondamentale per valutare gli effetti di qualsiasi trattamento. Nel ratto, circa il 98% del RGCs è noto per proiettare al controlaterale collicolo superiore (SC) (Forrester e Peters, 1967). L'applicazione di fluoro-oro (FG) sulla superficie di SC può etichettare quasi tutte le RGCs, in modo che possiamo concentrarci su questa neuroni più vulnerabili della retina nel glaucoma. FG è occupato dai terminali degli assoni delle cellule gangliari della retina e bilateralmente trasportato retrogrado alla sua somas nella retina. Confronta con marcatura retrograda di RGC mettendo FG a tronco di transected nervo ottico per 2 giorni, l'interferenza di sopravvivenza RGC è ridotto al minimo. Confronta con colorazione violetto cresolo che RGCs macchie, le cellule amacrine ed endotelio dei vasi sanguigni nello strato di cellule gangliari della retina, questo metodo di etichettatura più specifico per il RGC. Questo video descrive il metodo di marcatura retrograda di RGC FG applicando sulla superficie del SC. Le procedure chirurgiche includono perforazione del cranio; aspirando la corteccia per esporre la SC e l'applicazione di spugna di gelatina su tutta la superficie dorsale del SC sono mostrati. Consigli utili per evitare la massiccia emorragia intracranica e l'aspirazione delle SC sono state date.

Protocol

1. Anestetizzare il ratto di iniezione intra-peritoneale di ketamina (80mg/kg) e xilazina (8mg/kg) (rapporto tra volume a 2:1). Applicare lubrificante sterile unguento oculare per evitare l'essiccazione delle cornee durante l'intervento chirurgico.
2. Accorciare il pelo testa (da occhio a livello delle orecchie) e fissare la testa sul palco testa da un capo morsetto e impostarne il incisivi nella barra degli incisivi.
3. Disinfettati zona di operazione con una soluzione di iodio povidone al 10% seguito dal 70% di alcol.
4. Tagliare la pelle ed i muscoli per esporre cranio e suture (sagittale, coronale e trasversale suture) (Figura 1). Applicare analgesico, bupivicaine come una spruzzata di zona incisione (non superiore a 2 mg / kg).
5. Praticare un foro del cranio (ø 2x2 mm, 0,5 mm da entrambi i punti di sutura sagittale e trasverso) su ogni lato della sutura sagittale. Evitare la rottura delle meningi e del seno che giacciono sotto le suture.
   
   
   Figura 1. Caratteristiche del cranio topo vivo.
   
   
6. Taglio aperto le meningi con le forbici a molla, di evitare strappi.
7. Aspirare il contenuto cerebrale che si trova sulla superficie dorsale del collicolo superiore attentamente dalla pompa del vuoto e tre check-point può essere osservato:
   1. il colore del tessuto cerebrale cambia dal grigio al bianco al grigio
   2. interrompere l'aspirazione quando il fluido cerebrospinale incolore uscire
   3. attentamente allargare il più basso livello di aspirazione orizzontale per esporre il collicolo superiore giallastro coperto dalla durata
8. Aspirare il contenuto del cervello su SC fino a quattro bordi di SC può essere osservato direttamente al microscopio. La porzione di corteccia cerebrale rimosso deve essere ridotta al minimo per evitare effetti collaterali indesiderati (ad esempio, disfunzione motoria). Fare attenzione a non toccare il seno.
9. Assorbire il liquido nel foro con sottile striscia di cotone sterile per ottenere la superficie della SC più asciutto possibile. Poi, posto un sottile strato di gelatina spugna pre-impregnato con il 6% Fluoro-oro sulla superficie di SC (FG è occupato dai terminali degli assoni delle cellule gangliari della retina e bilateralmente trasportato retrogrado alla sua somas nella retina).
10. Riempire il buco con Gelfoam e chiudere la ferita pelle con clip sutura.
11. Gli animali sono stati autorizzati a recuperare sotto lampade a incandescenza per tenere in caldo. Analgesico, buprenorfina (100mcg/kg), viene applicato per via orale nell'acqua da bere per 5 giorni dopo l'etichettatura SC.

Discussion

1. Perché usare questo metodo chirurgico per la conta delle cellule gangliari della retina?
   
   Nel ratto circa il 98% delle cellule gangliari retiniche (RGC) sono noti per progetto al controlaterale collicolo superiore (SC). L'applicazione di fluoro-oro sulla superficie di SC può etichettare quasi tutti i RGCs, in modo che possiamo concentrarci su questa neuroni più vulnerabili della retina nel glaucoma. Confronta con marcatura retrograda di RGC mettendo FG a tronco di transected nervo ottico per 2 giorni, l'interferenza di sopravvivenza RGC è ridotto al minimo. Confronta con colorazione violetto cresolo che macchia la cellula amacrine, RGC endoteli e cellule del vaso sanguigno nello strato di cellule gangliari della retina, questo metodo è più specifico per il RGC.
   
   
2. Come evitare un eccessivo sanguinamento?
   
   Per prima cosa, assicurarsi che il ratto è adeguatamente anestetizzato controllando il tono muscolare e riflesso della cornea. Anestesia insufficiente causare sanguinamento estesa. In secondo luogo, di evitare operazioni che danneggiano il seno come la perforazione troppo vicino alla sutura o lacerazione delle meningi nella parete del seno. In terzo luogo, fare attenzione a mantenere la dura mentire superficialmente sul intatto SC specialmente nella regione nasale.
   
   
3. Quanto tempo ci vuole fino a quando il RGCs sono etichettati?
   
   Quattro giorni dopo l'etichettatura SC, il RGC può essere etichettato. Io di solito aspettare sette giorni per ottenere risultati migliori.