Etiquetado retrógrada de las células ganglionares de la retina por la aplicación de Fluoro-Gold en la superficie del colículo superior

Summary

Este vídeo describe el método de etiquetado retrógrada de las CGR mediante la aplicación de flúor-oro (FG) en la superficie del colículo superior (SC). Técnica consiste en perforar el cráneo, la aspiración de la corteza, y la aplicación de esponja de gelatina sobre toda la superficie dorsal de la SC.

Abstract

Células ganglionares de la retina (RGC) de conteo es esencial para evaluar degeneración de la retina, especialmente en el glaucoma. Etiquetado fiable RGC es fundamental para evaluar los efectos de cualquier tratamiento. En las ratas, aproximadamente el 98% de la CGR se sabe que los proyectos a la contralateral colículo superior (SC) (Forrester y Peters, 1967). La aplicación de flúor-oro (FG) en la superficie del SC puede etiquetar casi todos los de la CGR, por lo que podemos centrarnos en esta neurona retinal más vulnerables en el glaucoma. FG es absorbido por los terminales de los axones de las células ganglionares de la retina y de forma bilateral transportado retrógradamente a sus somas en la retina. Comparar con etiquetado retrógrado de RGC poniendo FG en tronco del nervio óptico seccionado por 2 días, la interferencia de la supervivencia de las CGR se reduce al mínimo. Comparar con manchas violeta de cresilo CGR que las manchas, las células amacrinas y el endotelio de los vasos sanguíneos en la capa de células ganglionares retinianas, este método de etiquetado es más específico a la CGR. Este vídeo describe el método de etiquetado retrógrada de las CGR mediante la aplicación de FG en la superficie del SC. Los procedimientos quirúrgicos incluyen la perforación del cráneo, la aspiración de la corteza para exponer la SC y la aplicación de esponja de gelatina sobre toda la superficie dorsal de la SC se muestran. Consejos útiles para evitar la hemorragia intracraneal masiva y la aspiración de la SC se les ha dado.

Protocol

1. Anestesiar la rata por vía intra-peritoneal de ketamina (80mg/kg) y xilazina (8mg/kg) (relación de volumen de 2:1). Aplique un ungüento lubricante ocular estéril para prevenir la sequedad de la córnea durante la cirugía.
2. Afeitarse el pelo de la cabeza (del ojo a la altura de los oídos) y fijar la cabeza en la etapa de la cabeza por una cabeza de sujeción y establecer sus incisivos en la barra de incisivos.
3. Desinfectar el área de operación con una solución de povidona yodada al 10% seguido de 70% de alcohol.
4. Cortar la piel y los músculos para exponer el cráneo y las suturas (puntos de sutura sagital, coronal y transversal) (Figura 1). Aplicar bupivicaína analgésicos, como un toque a la zona de la incisión (no más de 2 mg / kg).
5. Taladrar un agujero del cráneo (ø 2x2 mm, 0,5 mm de ambos puntos de sutura sagital y transversal) a cada lado de la sutura sagital. Evitar la ruptura de las meninges y los senos que yace bajo las suturas.
   
   
   Figura 1. Características en el cráneo de rata viva.
   
   
6. Cortar con tijeras las meninges primavera, evitar que se rompa.
7. Aspirar el contenido cerebral que se encuentra sobre la superficie dorsal del colículo superior con cuidado por la bomba de vacío y tres puntos de control se puede observar:
   1. el color de los cambios en el tejido cerebral de gris a blanco a gris
   2. dejar de aspirar cuando el incoloro líquido cefalorraquídeo sale
   3. cuidadosamente aumentar el nivel más bajo de succión horizontal para exponer el colículo superior, amarillenta cubierta por la duramadre
8. Aspirar el contenido del cerebro en SC hasta cuatro bordes del SC se puede observar directamente al microscopio. La porción de la corteza cerebral retirado debe mantenerse al mínimo para evitar efectos secundarios indeseables (por ejemplo, disfunción motora). Tenga cuidado de no tocar los senos paranasales.
9. Absorber el líquido en el agujero con rayas finas de algodón estéril para que la superficie de la SC lo más seco posible. Luego, coloque una capa delgada de esponja de gelatina remojadas con un 6% Fluoro-Gold en la superficie de Carolina del Sur (FG es absorbido por los terminales de los axones de las células ganglionares de la retina y de forma bilateral transportado retrógradamente a sus somas en la retina).
10. Llenar el agujero con espuma de gel y cerrar la herida de la piel con pinzas de sutura.
11. Los animales se les permitió recuperarse bajo la lámpara incandescente para mantener el calor. Analgésico buprenorfina, (100mcg/kg), se aplica por vía oral en el agua de bebida durante 5 días después de que el etiquetado SC.

Discussion

1. ¿Por qué usar este método quirúrgico para el recuento de células ganglionares retinianas?
   
   En las ratas alrededor del 98% de las células ganglionares de la retina (CGR) se sabe que los proyectos a la contralateral colículo superior (SC). La aplicación de flúor de oro en la superficie del SC puede etiquetar casi todos los de la CGR, por lo que podemos centrarnos en esta neurona retinal más vulnerables en el glaucoma. Comparar con etiquetado retrógrado de RGC poniendo FG en tronco del nervio óptico seccionado por 2 días, la interferencia de la supervivencia de las CGR se reduce al mínimo. Comparar con manchas violeta de cresilo que las manchas de la célula amacrinas, RGC y celular endotelio de los vasos sanguíneos en la capa de células ganglionares retinianas, este método es más específico a la CGR.
   
   
2. ¿Cómo evitar un sangrado excesivo?
   
   En primer lugar, asegúrese de que la rata es adecuadamente anestesiados por comprobar el tono muscular y reflejo de la córnea. Anestesia insuficiente causará sangrado abundante. En segundo lugar, evitar operaciones que puedan dañar el seno, tales como la perforación muy cerca de la sutura o el desgarro de las meninges en la pared del seno. En tercer lugar, tener cuidado de mantener la mentira dura superficialmente en la SC intacta especialmente en la región nasal.
   
   
3. ¿Cuánto tiempo se tarda hasta que la CGR están etiquetados?
   
   Cuatro días después de que el etiquetado de Carolina del Sur, la CGR puede ser etiquetado. Yo normalmente esperar siete días para obtener mejores resultados.