Retrograd Märkning av Retinal ganglion celler genom tillämpning av Fluoro-guld på ytan av Superior colliculi

Summary

Denna video beskriver metoden för bakåtsträvande märkning av RGC genom att tillämpa fluoro-guld (FG) på ytan av överlägsna colliculi (SC). Tekniken innebär borrning skallen, aspirerande cortex, och tillämpa gelatin svamp över hela dorsal yta SC.

Abstract

Retinal ganglion cell (RGC) räkna är viktigt att utvärdera näthinnedegeneration speciellt i glaukom. Pålitlig RGC märkning är grundläggande för att utvärdera effekter av någon behandling. I råtta är ca 98% av RGC: er kända för att projektet till kontralaterala överlägsna colliculi (SC) (Forrester och Peters, 1967). Tillämpa fluoro-guld (FG) på ytan av SC kan märka nästan alla RGC: er, så att vi kan fokusera på denna mest utsatta näthinnans neuron i glaukom. FG tas upp av axonet terminalerna av retinal ganglion celler och bilateralt transporteras retrogradely till SOMAS i näthinnan. Jämför med bakåtsträvande märkning av RGC genom att sätta FG på stumpen av transected synnerven i 2 dagar, är störningen av RGC överlevnad minimeras. Jämför med Cresyl violetta fläckar som färgar RGC: er, amakrina celler och endotel av blodkärl i näthinnan ganglion cellager, är denna märkning metod mer specifika för RGC. Denna video beskriver metoden för bakåtsträvande märkning av RGC genom att tillämpa FG på ytan av SC. Den kirurgiska förfaranden inkluderar borrning skallen, aspirerande hjärnbarken att exponera SC och tillämpa gelatin svamp över hela dorsal yta SC visas. Användbara tips för att undvika massiva intrakraniell blödning och aspiration av SC har fått.

Protocol

1. Bedöva råttan genom intraperitonealt injektion av ketamin (80mg/kg) och xylazin (8mg/kg) (volym uppgick vid 2:1). Applicera sterilt salva ögat smörjmedel för att förhindra uttorkning av hornhinnor under operation.
2. Raka huvudet päls (från öga till öronhöjd) och fixera huvudet på huvudet scenen av ett huvud klämma och sätta sina framtänder i framtand baren.
3. Desinfekteras operationsområdet med 10% povidonjodid lösning följt av 70% alkohol.
4. Skär hud och muskler att avslöja skallen och suturer (sagittal, koronalt och tvärgående suturer) (Figur 1). Applicera smärtstillande, bupivicaine som plaskar till snitt område (ej överstiga 2 mg / kg).
5. Borra ett kranium hål (Ø 2x2 mm, 0,5 mm från både sagittal och tvärgående suturer) på varje sida av sagittal sutur. Undvik bristning i hjärnhinnor och sinus ligger under suturer.
   
   
   Figur 1. Kännetecken på levande råtta skallen.
   
   
6. Skär öppna hjärnhinnorna till våren sax, undvika att riva.
7. Sug den cerebrala innehåll som ligger över den dorsala ytan av den överlägsna colliculi noggrant av vakuumpump och tre check-punkter kan noteras:
   1. färgen av förändringar hjärnvävnad från grå till vit till grå
   2. stoppa aspirerande när färglös cerebrospinalvätska kommer ut
   3. försiktigt förstora den lägsta sugnivå horisontellt för att exponera gulaktiga överlägsna colliculi omfattas av dura
8. Sug hjärnan innehåll via SC förrän fyra kanterna på SC kan observeras direkt under mikroskop. Den del av cerebral bort hjärnbarken bör hållas till ett minimum för att undvika oönskade biverkningar (t.ex. motorisk dysfunktion). Var noga med att inte vidröra sinus.
9. Sug upp vätskan i hålet med fin steril bomull rand för att göra ytan på SC så torr som möjligt. Sedan placera ett tunt lager av gelatin svamp i blöt med 6% Fluoro-guld på ytan av SC (FG tas upp av axonet terminalerna av retinal ganglion celler och bilateralt transporteras retrogradely till SOMAS i näthinnan).
10. Fyll hålet med gelfoam och nära huden såret med suturklämmor.
11. Djuren fick återhämta sig i glödlampor för att hålla värmen. Smärtstillande, buprenorfin (100mcg/kg), tillämpas oralt i dricksvatten för 5 dagar efter SC märkning.

Discussion

1. Varför använda denna kirurgiska metod för retinal ganglion celler?
   
   I råtta omkring 98% av retinal ganglion celler (RGC) är kända för projektet till kontralaterala överlägsna colliculi (SC). Tillämpa Fluoro-guld på ytan av SC kan märka nästan alla RGC: er, så att vi kan fokusera på denna mest utsatta näthinnans neuron i glaukom. Jämför med bakåtsträvande märkning av RGC genom att sätta FG på stumpen av transected synnerven i 2 dagar, är störningen av RGC överlevnad minimeras. Jämför med Cresyl violett färgning som färgar amakrina cellen RGC och endothelia cell av blodkärl i näthinnan ganglion cellager, är denna metod mer specifika för RGC.
   
   
2. Hur man undviker kraftig blödning?
   
   Kontrollera först att råttan är ordentligt bedövat genom att kontrollera muskeltonus och hornhinna reflex. Otillräcklig narkos kommer att orsaka omfattande blödning. För det andra undviker verksamhet som kan skada sinus som borrning för nära sutur eller riva av meningerna in i sinus väggen. Tredje, var noga med att hålla dura ligger ytligt på SC intakt särskilt i näsan regionen.
   
   
3. Hur lång tid tar det tills RGC: er är märkta?
   
   Fyra dagar efter SC märkning kan RGC märkas. Jag väntar normalt sju dagar för bättre resultat.