Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen door toepassing van fluor-Gold op het oppervlak van Superior colliculus

Published: June 17, 2008 doi: 10.3791/819

Summary

Deze video beschrijft de methode van retrograde etikettering van RGC door het toepassen van fluoro-goud (FG) op het oppervlak van superieure colliculus (SC). Techniek omvat het boren van de schedel, opzuigen van de cortex, en het toepassen van gelatine spons over de gehele dorsale oppervlak van de SC.

Abstract

Retinale ganglion cel (RGC) tellen is essentieel om retinadegeneratie evalueren vooral in glaucoom. Betrouwbare RGC etikettering is fundamenteel voor het evalueren van de effecten van een eventuele behandeling. In de rat, is ongeveer 98% van RGC waarvan bekend is dat het project aan de contralaterale superieure colliculus (SC) (Forrester en Peters, 1967). Het toepassen van fluoro-goud (FG) op het oppervlak van SC kan label bijna alle RGC, zodat we kunnen op deze meest kwetsbare netvlies neuron focus in glaucoom. FG wordt ingenomen door het axon terminals van retinale ganglioncellen en bilateraal retrogradely getransporteerd naar de SOMA in het netvlies. Vergelijk met retrograde etikettering van RGC Door FG op stronk van doorsneden oogzenuw voor 2 dagen, is de interferentie van RGC overleven geminimaliseerd. Vergelijk met cresyl violet vlekken die vlekken RGC, amacrine cellen en endotheel van het bloedvat in de retinale ganglion cel laag, deze labeling methode is meer specifiek voor de RGC. Deze video beschrijft de methode van retrograde etikettering van RGC door het toepassen van FG op het oppervlak van SC. De chirurgische procedures omvatten het boren van de schedel, aspiratie van de cortex naar de SC bloot te leggen en het toepassen van gelatine spons over de gehele dorsale oppervlak van SC worden getoond. Nuttige tips voor het vermijden van grote intracraniële bloeden en aspiratie van de SC zijn gegeven.

Protocol

  1. Verdoof de rat door intraperitoneale injectie van ketamine (80mg/kg) en xylazine (8mg/kg) (volume ratio 2:1). Breng een steriel glijmiddel oog zalf om uitdroging te voorkomen van het hoornvlies tijdens de operatie.
  2. Scheer het hoofd bont (van oog tot het oor-niveau) en bevestig de kop op de kop stadium door een hoofd klem en zijn snijtanden in de snijtand bar.
  3. Gedesinfecteerd de operatie gebied met 10% povidonjood-oplossing, gevolgd door 70% alcohol.
  4. Snijd de huid en de spieren om de schedel en de hechtingen (sagittale, coronale en dwarse naden) (Figuur 1) bloot te leggen. Van toepassing zijn pijnstillende, bupivicaine als een splash om incisiegebied (niet tot 2 mg / kg bedraagt).
  5. Boor een gat schedel (ø 2x2 mm, 0,5 mm van zowel de sagittale en transversale hechtingen) aan elke kant van pijlnaad. Vermijd breuk van hersenvliezen en de sinus ligt onder de hechtingen.

    Kenmerken van levend rat schedel.
    Figuur 1. Kenmerken van levend rat schedel.

  6. Opengesneden de hersenvliezen in het voorjaar een schaar, niet scheurt.
  7. Zuig het cerebrale inhoud die ligt over het dorsale oppervlak van de superieure colliculus zorgvuldig door de vacuümpomp en drie check-points kan worden waargenomen:
    1. de kleur van hersenweefsel verandert van grijs naar wit naar grijs
    2. stop opzuigen als de kleurloze hersenvocht naar buiten komen
    3. zorgvuldig vergroten van de laagste zuigkracht horizontaal naar de geelachtige superieure colliculus gedekt door de dura bloot
  8. Aspireren de hersenen inhoud via SC tot vier randen van SC kan worden waargenomen direct onder de microscoop. Het deel van de verwijderde hersenschors moet worden beperkt tot minimum aan ongewenste neveneffecten (bijv., motorische stoornissen) te vermijden. Wees voorzichtig dat u de sinus te raken.
  9. Absorberen de vloeistof in het gat met fijne steriele katoenen streep om het oppervlak van de SC zo droog mogelijk. Plaats dan een dun laagje gelatine spons pre-doorweekt met 6% Fluoro-Gold aan het oppervlak van SC (FG wordt ingenomen door het axon terminals van retinale ganglioncellen en bilateraal retrogradely getransporteerd naar de SOMA in het netvlies).
  10. Vul het gat met gelfoam en sluit de huid wond met hechtdraad clips.
  11. De dieren werden toegelaten om te herstellen onder gloeilamp warm te houden. Pijnstillende, buprenorfine (100mcg/kg), wordt oraal toegepast in het drinkwater gedurende 5 dagen na SC etikettering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

  1. Waarom gebruik maken van deze chirurgische methode om retinale ganglion cellen?

    In de rat ongeveer 98% van retinale ganglioncellen (RGC) is bekend dat het project aan de contralaterale superieure colliculus (SC). Toepassing van fluor-goud op het oppervlak van SC kan bijna alle label van het RGC, zodat we kunnen op deze meest kwetsbare netvlies neuron focus in glaucoom. Vergelijk met retrograde etikettering van RGC Door FG op stronk van doorsneden oogzenuw voor 2 dagen, is de interferentie van RGC overleven geminimaliseerd. Vergelijk met cresyl violet vlekken die vlekken het amacrine cel, RGC en endotheel cel van het bloedvat in de retinale ganglion cel laag, deze methode wordt meer specifiek voor de RGC.

  2. Hoe overmatig bloeden te vermijden?

    Controleer eerst of de rat goed is verdoofd door het controleren van spierspanning en het hoornvlies reflex. Onvoldoende verdoving zal leiden tot een uitgebreide bloeden. Ten tweede, vermijd operaties die de sinus zoals boren te dicht bij de hechtdraad of scheuren van de hersenvliezen in de sinus muur zal beschadigen. Ten derde, wees voorzichtig te houden van de dura ligt oppervlakkig op de SC intact vooral bij de neus regio.

  3. Hoe lang duurt het tot het RGC zijn gelabeld?

    Vier dagen na de SC etikettering, kan het RGC worden geëtiketteerd. Ik heb normaal gesproken wacht gedurende zeven dagen voor betere resultaten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

De auteurs willen graag bedanken voor de steun van National Glaucoom Program van de Amerikaanse Health Assistant Foundation.

References

  1. Ahmed, A. K. M. F., Dong, K., Sugioka, K., Yamadori, T. Retrograde double labeling of retinal ganglion cells in the newborn and adult albino rat. Neurosci. Protocols. 1, 1-11 (1996).
  2. Chan, H. C., Chang, R. C. C., Ip, A. K. C., Chiu, K., Yuen, W. H., Zee, S. Y., So, K. F. Neuroprotective effects of Lycium barbarum Lynn on protecting retinal ganglion cells in an ocular hypertension model of glaucoma. Experimental Neurology. 203, 269-273 (2007).
  3. Forrester, J., Peters, A. Nerve fibers in the optic nerve of rat. Nature. 214, 245-247 (1967).
  4. Ji, J. Z., Elyaman, W., Yip, H. K., Lee, V. W. H., Yick, L. W., Hugon, J., So, K. F. CNTF promotes survival of retinal ganglion cells after induction of ocular hypertension in rats: the possible involvement of STAT3 pathway. European Journal of Neuroscience. 19, 265-272 (2004).
  5. Li, R. S., Chen, B. Y., Tay, D. K., Chan, H. H. L., Pu, M. L., So, K. F. Melanopsin-Expressing Retinal Ganglion Cells Are More Injury-Resistant in a Chronic Ocular Hypertension Model. Investigative. Ophthalmology & Visual Science. 47, 2951-2958 (2006).

Tags

Neurowetenschappen Retrograde labeling retinale ganglioncellen oogheelkunde onderzoek superieure colliculus experimentele glaucoom
Retrograde Labeling van retinale ganglioncellen door toepassing van fluor-Gold op het oppervlak van Superior colliculus
Play Video
PDF DOI

Cite this Article

Chiu, K., Lau, W., Yeung, S., Chang, More

Chiu, K., Lau, W., Yeung, S., Chang, R. C., So, K. Retrograde Labeling of Retinal Ganglion Cells by Application of Fluoro-Gold on the Surface of Superior Colliculus. J. Vis. Exp. (16), e819, doi:10.3791/819 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter