Summary
ראשי ניתק הדופמין במוח התיכון בתרביות תאים מאפשרים ללמוד את המאפיינים presynaptic של נוירונים דופמין. הם יכולים לשמש כדי לפקח בזמן אמת שחרור הדופמין קינטיקה של חלבונים / רמות ה-mRNA של הרגולטורים של exocytosis דופמין. כאן, אנו מראים לך איך לייצר מן התרבויות הללו בילודים מכרסמים.
Abstract
היכולת ליצור תרביות תאים העיקרי של נוירונים דופמין מאפשר ללמוד את המאפיינים presynaptic של נוירונים דופמין במנותק קלט מערכתית ממקומות אחרים במוח. במעבדה שלנו, אנו משתמשים אלו נוירונים להעריך קינטיקה שחרור הדופמין באמצעות סיבי פחמן amperometry, כמו גם רמות הביטוי של גנים הקשורים לדופמין חלבונים באמצעות PCR כמותי ו immunocytochemistry. בסרטון הזה, אנו מראים לך איך אנחנו מייצרים אלה תרבויות מן בילודים מכרסמים.
התהליך כולל מספר שלבים, כולל ציפוי של האסטרוציטים גליה קליפת המוח, את מיזוג של תרבות התקשורת העצבית על ידי תא המצע גליה, דיסקציה של המוח התיכון בילודים, את מערכת העיכול, מיצוי ציפוי של נוירונים דופאמין תוספת של גורמים neurotrophic ל להבטיח את הישרדות התא.
יישומים מתאימים להכנת כזה כוללים electrophysiology, immunocytochemistry, PCR כמותי, מיקרוסקופיה וידאו (כלומר, של איחוי בזמן אמת שלפוחי עם קרום התא), הכדאיות מבחני תא מסכי toxicological אחרים.
Protocol
ההכנה שקדמו תרבות
הערה: ** ותאי גלייה חייב להיות מצופה היטב מראש, כך שיש להם זמן להתרבות ולכסות את החלק התחתון של המנות. עבור עכברים עם הרקע הגנטי טיפוסיות או ניסיוני, הקפד להתאים לתרבויות גליה ואת עצבי במונחים של גנוטיפ.
הערה: ** 1-7 ימים לפני הניתוח, להכין מדיום העצבית טריים להחליף את מדיום גלייה את הכלים עם 2ml.
הערה: ** ביום שלפני הניתוח, את הפריטים הבאים צריכים להישאר תחת אור UV לילה:
- 4 צלחות לנתיחה
- 2 דיסוציאציה צלוחיות עם בר מיקרו מגנטי סערה
- בקבוקון 2 כמוסות (עם 2 חורים קטנים הציצו בחלק העליון)
- מורחים את טבעות להחליק (וגם מעיל EtOH 70%) - לעזוב את התיבה פתוחה גם
- לפחות 2 ארגזים מלאים צהוב (10-200μl) פיפטה טיפים
- 1 קופסה של כחול (100-1000μl) פיפטה טיפים
יום התרבות
הערה: * הקפד לא לגעת בשום דבר שנשאר בחוץ UV לילה!
שמירה על סביבה סטרילית מתחת למכסה המנוע הוא מאוד חשוב.
1) הגדרת:
הערה: ** מניחים בצד את כל החומרים הקפואים כדי להפוך פתרון papain.
- מלקחיים נקי EtOH עם 70%. כיסוי כל קצה עם קצה pipet סטרילי צהוב. השתמש למקום טבעות שקופיות סטרילי בתיבה שלהם.
- חם בצלחת:
- מניחים צלחת mini-magnetic/hot מתחת למכסה המנוע עם מבחנה 1000ml מלא עד 500-600ml DH 2 O ובר גדול ומערבבים מגנטי.
- מקום בדיסק בכוס קלקר רק מעל פני המים.
- החלק את המדחום בתוך חור קטן הדיסק קלקר. חיוג חום צריך להיות מעט מעל 2 (עבור טמפ של 34 מעלות צלזיוס) ואת חיוג ומערבבים יש ~ 5-6.
- PBS:
- הכן PBS סטרילי ומלא צינורות 15 מ"ל 15 מ"ל סטרילי עם 4-6 (הקפד לשמור על סטריליות
טכניקה). - מניחים את הצינורות ואת בקבוק המניות על הקרח ליד מכסה המנוע.
- הכן PBS סטרילי ומלא צינורות 15 מ"ל 15 מ"ל סטרילי עם 4-6 (הקפד לשמור על סטריליות
- Carbogen:
- לשבור stripette 5 מ"ל במחצית והעברתה דרך פקק גומי, כך קצה stripette הוא מבצבץ סוף רחב של הפקק.
- הנח את הפקק בבקבוק 500ml עם 400-500ml DH 2 O (סוף השבור של stripette צריך להיות 2 DH O).
- חיבור צינור על פתיחת בצד של הבקבוק.
- חותכים את קצה קצה פיפטה צהוב להתחבר זה עד הסוף של הצינור (עם הצד החתוך פונה החוצה).
חבר את המיכל carbogen אל קצה stripette 5 מ"ל.
- הכן papain sol'n:
- * שימוש בטכניקה סטרילית זהיר.
- מערבבים בתוך שפופרת 50 מ"ל סטרילי.
- סנן papain sol'n לתוך הבקבוקון דיסוציאציה:
- השתמש סינון Steriflip היחידה להעביר בקבוקון דיסוציאציה דרך 25ml stripette (או המקום מסנן חדש מזרק 0.2μm על קצה מזרק הבוכנה 20ml,
להסיר את הבוכנה ולהשתמש stripette (25mL) להעביר את כל sol'n papain לתוך המזרק. - סנן לתוך הבקבוקון דיסוציאציה).
- שווי את הבקבוקון, להוסיף מזרק סטרילי דרך החור בכובע ולצרף מסנן סטרילי מזרק 0.2μm לבסיס של המזרק.
- חבר את carbogen את המסנן parafilm זה המקום. מניחים את הבקבוקון בתוך קלקר דיסק / בעל.
* בר מיקרו מגנטי ומערבבים חייב להיות נעים.
* גז חייב להיות מה שהופך אותו לתוך הבקבוקון.
* הטמפרטורה חייבת לייצב את 34 ° C.
- השתמש סינון Steriflip היחידה להעביר בקבוקון דיסוציאציה דרך 25ml stripette (או המקום מסנן חדש מזרק 0.2μm על קצה מזרק הבוכנה 20ml,
- Dissection הכנה:
- תביאו את המיקרוסקופ לנתיחה מתחת למכסה המנוע.
- הנח את כל הכלים לנתיחה על רדיד אלומיניום, תרסיס עם EtOH 70%, לשפוך את עודפי לעזוב מתחת למכסה המנוע לייבוש.
- הכן בינוני העצבית:
- עזוב 30 מ"ל של מדיום העצבית טרי בחממה.
- פריסת 1 ריבוע גדול של נייר אלומיניום ו - 12 ריבועים קטנים יותר. השאירו את המספריים עריפת ראש עם רדיד האלומיניום. מלאו קופסה קטנה הקלקר במי קרח ולהשאיר את כל מחוץ למכסה המנוע.
- Prep ההרדמה (קטמין 0.075ml ו 0.075ml xzylazine).
- קבל לפחות 12 גורים (P0-P2) עבור 100 צלחות. עבור עכברים, לוודא שיש התאמה גנוטיפ של פסולת כולו. אם גנוטיפ אינו ידוע, תאים צלחת מכל הגור על צלחת נפרדת, לשמור תיעוד מדויק של מספרים העכבר ולהתאים אותם עם צלחות תרבית תאים ולוודא את הרקע הגנטי של המצע גליה אחידה על פני תרביות תאים.
2) Dissection
- להרדים את בעל החיים הראשון עם זריקה intraperitoneal. כאשר החיה מראה הרגעה ולא מגיב לבדוק זנב קפיצי, לשים אותו קרח למשך 30 שניות (עד היפותרמיים). יש לשטוף אחת קטנה רדיד אלומיניום מרובע, decapitation מספריים, וראש EtOH עם 70%.
- לערוף, לאפשר לראש ליפול על ריבוע רדיד אלומיניום ולעבור מתחת למכסה המנוע. להסיר בעדינות את המוח לתוך שפופרת של 15 מ"ל קר כקרח PBS. מניחים את הצינור בחזרה על קרח תוך הסרת המוח הבא.
- חזור על שלבים אלה הראשונה עד ישנם 3 מוחות על הקרח. יוצקים את כל 3 מוחות PBS על צלחת את הנתיחה הראשונה מתחת למיקרוסקופ. הסר בסעיף המתאים של המוח (VTA) ולהשתמש pipet להעביר את קטעי לתוך papain sol'n. התחל טיימר כאשר מגזרים הראשון ללכת פנימה
- חזור על צעדים 3 עד שכל המוחות נמצאים מתעכל ב papain. הזמן הממוצע לעיכול צריך להיות 2 שעות. קטעי הראשון יהיה כבר שעה על 1 עד האחרונים להיכנס
נסה לפצל את ההבדל. - * במהלך עיכול:
- ודא זמני באמבטיה היא 34 ° C.
- מגזרי יכול לדבוק הבר לבחוש בהתחלה, אבל צריך להתפשט ככל שעובר הזמן. אם לא, הקש על החלק התחתון של המכל.
3) טחינה דקה:
- בעזרת פיפטה העברה, להעביר את קטעי המוח שפופרת 15 מ"ל סטרילי (נסו להימנע מעודף papain sol'n) ולשטוף אותם 3 פעמים עם 2ml של המדיום גליה חימם מן החממה. לאחר שהחנה את כלי התקשורת גליה בצינור, לאפשר מגזרים להתיישב ואז להסיר בזהירות כמו sol'n האפשר מבלי להפריע מגזרים. שנה pipettes כדי למנוע זיהום!
** לא שומרים sol'n כי יוסר. - בעזרת פיפטה העברת טרי להתחיל triturations ב 2ml התקשורת גליה. Triturate 25 פעמים (להימנע מכניסה פנימה בועות אוויר) ולתת הצינור לשבת במשך 3 דקות, עד קטעים undissociated להתיישב. השתמש פיפטה העברת להסיר שמור sol'n ככל האפשר מבלי להפריע מגזרים בתחתית. שמור את supernatant בצינור (סטרילי) חדש 15m.
- חזור על השלב הקודם בעזרת פיפטה 1000μl ו פיפטה 200μl עד ניתק לחלוטין.
- Triturate 10 פעמים עם פיפטה העברה, או עד התאים resuspended לחלוטין sol'n.
4) ציפוי תאים
- בעזרת פיפטה סטרילית קצה צהוב מכסה כל קצה מלקחיים, בזהירות טיפה טבעת להחליק מרוכז כמו לזכוכית טוב ככל האפשר בתוך כל מנה.
- שים 10μl של פתרון התא על hemacytometer ו לספור. (תכלול ההמונים זבל).
- תכפיל את מספר התאים על ידי 10. זהו את מספר התאים / μl. הפרד 1,000,000-1,500,000 (או צפיפות הרצוי) על ידי מספר זה. זהו המספר של μl להוסיף לכל מאכל.
- השתמש קצה פיפטה להחליק טבעות על מרכז טוב של כל מנה ככל שתוסיף μl המנה המתאימה /. פלייט אותם בעדינות ולעבור טיפים כל מאכל.
- הוסף 100μl (של בדילול מלא) sol'n GDNF בתוך הטבעת שקופיות של כל מנה.
- בשלב זה, במקום מגשי בחממה ולהביא את עצבי בינוני בחדר קר.
- אפשר תאים ליישב בין לילה.
- למחרת: טבעות להסיר (בעזרת פיפטה סטרילית טיפים חדשים המכסים את הטיפים מלקחיים עבור כל מנה)
5) עיכוב mitotic: למחרת
- מדולל aliquots FDU של 1:10 המניות 1000x ידי הוספת 200μl מניות FDU כדי ממ 1.8 מ"ל סטרילי.
- הוסף 20μl בדילול FDU sol'n לטבעת החיצונית של כל מנה. שינוי עצות פיפטה לעתים קרובות. מכסים לחזור החממה.
* להפריע את הכלים מעט ככל האפשר בימים 7-10 הבא. בדוק מנות נגועים ולהסיר כל המנות נגוע ב סימנים ראשונים של זיהום. תרבויות מוכנים לבדיקה תוך 3 שבועות.
MEDIA / פתרונות
עצבי בינוני
(עבור 200 מ"ל)
** הטוב ביותר אם מותנה גליה מ צלוחיות לילה לפני השימוש עבור רוחץ / טחינה דקה
| מרכיב | כמות | הערות |
| BSA 5% | 0.5 גרם | שבר V |
| ממ נוזלי | 94.0 מ"ל | סיגמא |
| DMEM נוזלי | 80.0 מ"ל | סיגמא |
| F-12 נוזלי | 20.0 מ"ל | סיגמא |
| גלוקוז 45% נוזל | 1.50 מ"ל | סיגמא פתרון |
| גלוטמין 200mm | 0.5 מ"ל | פתרון Aliquotted סיגמא |
| Diporzio קונצרט כלשהו. | 2.0 מ"ל | סיגמא פתרון |
| נוזלי Catalase | 0.1 מ"ל | |
| חומצה Kynurenic 0.5m | 200μl | ב 1N NaOH |
| HCL 5N | 50 μl |
- שילוב החומרים (BSA הולך אחרון) ב 250אני בקבוק פלסטיק.
- התווית סינון, ושומרים במקרר.
Kynurenic חומצה
(FW = 189.2)
0.5m = 94.6mg/ml
הפוך את המניות 8ml: 756.8mgKA/8ml NaOH 1N ו פיפטה לתוך aliquots סטרילי של 200μl
DiPorzio מדיה
א) DiPorzio קונצרט כלשהו. מניות:
| NEED | לשלב | Alliquot | ||||||
| תוסף | ממס | שפופרת | כמות | מ"ל | מ"ל / שפופרת | קונצרט כלשהו. | כמות | # Aliq. |
| אינסולין | HCL 20mm (1) | פלסטי | טבליות של 250 בקבוק | 10 | 1 | 25mg/ml | 25mg | 10 |
| Transferrin | הנק של | 500 מ"ג בקבוק | 5 | 1 | 100mg/ml | 100 מ"ג | 5 | |
| SOD | הנק של | 70mg בקבוק | 14 | 1 | 5mg/ml | 5mg | 14 | |
| Putrescine | הנק של | 50 מ"ג | 3 | 0.12 | 20mg/ml | 2.4mg | 21 | |
| Na 2 3 SEO | הנק של | 0.104mg | 10 | 0.5 | 10μg/ml | 5.2μg | 20 | |
| T3 | 10mm NaOH | 2mg | 10 | 0.1 | 0.20mg/ml | 0mg | 100 | |
| הפרוגסטרון | 100% EtOH | זכוכית | 12.5mg | 10 | 0.05 | 1.25mg/ml | השתמש pipet | |
| קורטיזול | 100% EtOH | זכוכית | 20mg | 10 | 0.02 | 2.00mg / ml | השתמש pipet | |
- 20mm HCl = 41.5μl קונצרט כלשהו. HCl/25ml.
- הפוך את המניות 1mg/ml ולהוסיף 104μl ל 10 מ"ל.
ב) מלאי DiPorzio מדיה:
| תוסף | סכום (מ"ל) | (מ"ל) סכום X2 | סופי קונצרט כלשהו. מיקרוגרם / מ"ל | סופי קונצרט כלשהו. Molarity |
| הפרוגסטרון | 0.05 | 0.1 | 0.06 | 200nM |
| קורטיזול | 0.02 | 0.04 | 0.04 | 125nM |
| האנק של BSS | 6.21 | 12.42 | ||
| אינסולין | 1 | 2 | 25 | |
| Na 2 3 SEO | 0.5 | 1 | 0.01 | 30nm |
| T3 | 0.1 | 0.2 | 0.02 | 30nm |
| SOD | 1 | 2 | 5 | |
| Putrescine | 0.12 | 0.24 | 2.4 | 15nM |
| Transferrin | 1 | 2 | 100 |
- השתמש צינור polyproylene 15 מ"ל סטרילי כדי להוסיף את פרוגסטרון קורטיזול. השתמש pipet aspirator ואקום כדי לזרז אידוי של EtOH: (להשתמש stripette 5 מ"ל שבור לשניים מקום בחצי הדרך למטה לתוך הצינור נזהר מאוד שלא לשאוב נוזל EtOH החזק pipet בבטחה במקום עם Kimwipes ואז להביא את קצה. למטה כדי לסמן את 500μl ממוקם בצד של הצינור.
- מוסיפים את aliquots הבאים לפי הסדר שהם מופיעים בתרשים לעיל.
- לאחר תוספת של אינסולין, מה שהופך את מעונן sol'n, להוסיף 20μl של 1N NaOH לנטרל את החומציות. Sol'n צריך ללכת מצהוב ורוד ברור מיד. כמו כן, לאחר תוספת של transferrin, מיד להוסיף 20μl של 1N NaOH, כדי לנטרל את החומציות ומניעת היווצרות משקעים.
- צייר את 10ml לתוך pipet לחלק סרולוגיות לתוך 5 aliquots (צרור אחד).
- חנות @ -20 ° C.
- מאי לעשות 2 קבוצות בבת אחת.
דיסוציאציה מדיה
א Papain (עבור בקבוקון 1):
** היכונו ליום של ציפוי ממש לפני לנתיחה.
| מרכיב | סכום </ Strong> | (הערות) סופי קונצרט כלשהו. |
| ציסטאין מים | 7.8mL | 1mm ציסטאין |
| Papain | משתנה (* 190μl לבקבוק של 44.0mg/ml) | 20 יחידות / מ"ל (400 יחידות סה"כ עבור שווה 20ml של sol'n) |
| H & B קונצרט כלשהו. | 2ml | |
| Carbogen | 95% O2 CO2 + 5% | |
| HCl 5N | 10μl | |
| פנול אדום 0.5% | 20μl | 0.001% |
| Kynurenate 0.5m | 10μl | (ב 1N NaOH) 0.5mm |
- הוסף papain למים ציסטאין FIRST.
- הוסף את H & B קונצרט כלשהו., Kynurenate, HCl, פנול אדום.
- סנן לתוך בקבוקון דיסוציאציה (כפי שמתואר הגדרת כיוונים) ולהתחבר carbogen.
ב H & B תרכיז (100 מ"ל של 5X):
| המצרכים | MW | Powder/50ml H 2 O | קונצרט כלשהו. (ז) | מערבבים (מ"ל) | סופי קונצרט כלשהו. (מ"מ) |
| NaCl | 58.44 | 11.699 גרם | 4 | 14.5 | 116 |
| KCl | 74.56 | 3.728 גרם | 1 | 2.7 | 5.4 |
| NaHCO 3 | 84.01 | 4.2 גרם | 1 | 13 | 26 |
| לאא 2 PO 4 * H 2 O | 137.99 | 6.90 גר ' | 1 | 1 | 2 |
| MgSO 4 | 120.38 | 6.019 גרם | 1 | 0.5 | 1 |
| EDTA (ED2-SS) | 292 | סיגמא 5% (לעשות 5g/100ml המלאי) | 0.134 | .3722 | 0.5 |
| גלוקוז | 180 | Sigma 45% | 2.5 | 5 | 25 |
| TC H 2 O | 62.93 |
- מערבבים כמויות מפתרונות המניות.
- מתחלקים aliquots 4ml.
- הוסף aliquot למים ציסטאין לאחר הוספת papain.
ג מים ציסטאין (157.5ml של 1X):
| המצרכים | MW | רכיבי אבקת (מ"ג) | H 2 O (מ"ל) | במלאי קונצרט כלשהו. (מ"מ) | מערבבים (מ"ל) | סופי קונצרט כלשהו. (מ"מ) |
| CaCl 2 | 147.2 | 736 | 10 | 500 | 0.6 | 1.9mM |
| ציסטאין | 121.7 | (1.5) | 24 | 20mm (0.02M) | 10 | 1.27mM (0.88) |
| TC מים | 146.9 |
- הפוך לשמור sol'n המניות של CaCl2 0.5m ב 4 ° C
- הפוך sol'n אחד להשתמש של ציסטאין בשילוב עם מרכיבים אחרים
- מתחלקים aliquots של 10 מ"ל 15.75 ולאחסן ב 4 ° C
GDNF הכנה
- Aliquot הכנה:
- ממיסים סטרילי, גלולה lyophilized של 5μg GDNF עם 2.4mL מים deionized סטרילית. ריכוז זה sol'n GDNF = 2.08μg/mL.
- הפץ את GDNF 2.08μg/mL sol'n לתוך 76.9μl aliquots ב cryovials סטרילית. זה 160ng = לכל בקבוקון.
- חנות ב -20 ° C.
- בנוסף תרבויות:
- להפשיר 1 aliquot לכל 8 מנות.
- מדולל aliquot ידי הוספת 723.1μl התקשורת העצבית / aliquot. זה יגרום sol'n של 160ng/800μl GDNF.
- הוסף 100μl של sol'n זה 2ml של המדיום בצלחת עבור כל הריכוז הסופי של 10ng GDNF לכל מ"ל.
FDU הכנה
FDU-sol'n 1000x במלאי:
| מרכיב | כמות | (הערות) סופי קונצרט כלשהו. |
| Uridine | 247 מ"ג | 16.5 מ"ג / מ"ל |
| 5-FDU (5-fluorodeoxyuridine) | 100 מ"ג (בקבוק) | 6.7 מ"ג / מ"ל |
| TC מים | 15 מ"ל |
- בצע קצת מעל 15 מ"ל של uridine מ"ג / מ"ל 16.5.
- הוסף 15 מ"ל uridine sol'n לבקבוק 100 מ"ג FDU לעשות 6.7 מ"ג / מ"ל sol'n FDU.
- מתחלקים aliquots 200μl ולהקפיא ב -20 ° C.
מדולל שימוש:
- לעכב את הצמיחה של תאים לא עצביים. מדולל 1:10 המניות 1000x ידי הוספת מניות 200μl כדי ממ 1.8 מ"ל.
- הוסף FDU בדילול 20μl לטבעת החיצונית של כל מנה. שינוי עצות pipet לעתים קרובות. מכסים לחזור החממה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטות שתוארו כאן לאפשר רזולוציה נאה של תכונות מורפולוגיות neurochemical של נוירונים דופמין מרכזית אחרת הם לא זמינים מערכתית או גישת vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
העבודה נתמכה על ידי DK065872 (ENP), קרן משפחת סמית פרס הצטיינות במחקר ביו (ENP), F31 DA023760 (BMG, ENP) ו P30 NS047243 (Tufts המרכז Neuroscience Research).
Materials
| Materials are included in the protocol text. |
References
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
- Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
- Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).
