Summary
دوبامين الدماغ المتوسط الابتدائي الثقافات الخلية فصلها تسمح لدراسة خصائص الخلايا العصبية من قبل المشبكي الدوبامين. يمكن استخدامها لرصد الوقت الحقيقي الحركية الإفراج الدوبامين والبروتين / مرنا مستويات الدوبامين إيماس من المنظمين. هنا ، ونحن تبين لكم كيف تولد هذه الثقافات من الولدان القوارض.
Abstract
القدرة على خلق ثقافات الخلية الأولية الدوبامين من الخلايا العصبية يسمح لدراسة خصائص الخلايا العصبية من قبل المشبكي الدوبامين في عزلة عن غيرها من المدخلات المنهجية في الدماغ. في المختبر ، ونحن نستخدم هذه الخلايا العصبية الحركية لتقييم إطلاق الدوبامين باستخدام الكربون amperometry الألياف ، فضلا عن مستويات التعبير عن الجينات والبروتينات ذات الصلة الدوبامين باستخدام PCR الكمي وكيمياء سيتولوجية مناعية. في هذا الفيديو ، ونحن تبين لكم كيف تولد هذه الثقافات من الولدان القوارض.
وتنطوي العملية على عدة خطوات ، بما في ذلك الطلاء من الخلايا النجمية الدبقية القشرية ، وتكييف وسائل الإعلام للثقافة العصبية خلية الركيزة الدبقية ، وتشريح الدماغ المتوسط في حديثي الولادة ، والهضم ، واستخراج والطلاء الدوبامين من الخلايا العصبية وإضافة إلى عوامل عصبية ضمان بقاء الخلية.
التطبيقات المناسبة لإعداد مثل هذه تشمل الكهربية ، كيمياء سيتولوجية مناعية ، PCR الكمي ، المجهري الفيديو (أي من الانصهار حويصلي في الوقت الحقيقي مع غشاء البلازما) ، وبقاء الخلية المقايسات شاشات السمية الأخرى.
Protocol
إعداد يسبق الثقافة
ملاحظة : يجب أن يكون مطلي ** الخلايا الدبقية في وقت مبكر بحيث يكون لديهم الوقت لتتكاثر وتغطية الجزء السفلي من الأطباق. بالنسبة للفئران مع الخلفية الوراثية شاذة أو التجريبية ، للتأكد من تطابق الثقافات الدبقية والخلايا العصبية من حيث التركيب الوراثي.
ملاحظة : ** 1-7 أيام قبل التشريح ، وإعداد المتوسطة الخلايا العصبية الجديدة واستبدال المتوسطة الدبقية في الأطباق مع 2ml.
ملاحظة : ** وفي اليوم قبل التشريح ، البنود التالية تحتاج إلى اليسار بين عشية وضحاها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية :
- تشريح لوحات 4
- 2 قنينة تفارق مع قضيب تحريك مغناطيسي الصغرى
- قبعات القارورة 2 (مع 2 مطعون ثقوب صغيرة في أعلى الصفحة)
- انتشرت حلقات الانزلاق (ومعطف في EtOH 70 ٪) -- ترك مربع أيضا فتح
- على الأقل 2 مربعات كاملة من نصائح ماصة الصفراء (10 200μl)
- 1 مربع من اللون الأزرق (100 1000μl) ماصة نصائح
يوم الثقافة
ملاحظة : * تأكد من عدم لمس أي شيء استبعد الأشعة فوق البنفسجية ليلة وضحاها!
الحفاظ على بيئة معقمة تحت غطاء محرك السيارة مهم جدا.
1) إعداد :
ملاحظة : ** جانبا جميع المكونات المجمدة لجعل الحل غراء.
- نظيف مع ملقط EtOH 70 ٪. تغطية كل طرف مع طرف الماصة الصفراء العقيمة. استخدام لوضع خواتم الشريحة العقيمة في مربع بهم.
- صفيحة ساخنة :
- وضع لوحة تحت غطاء محرك السيارة mini-magnetic/hot مع ملء كوب 1000ml 500 - 600ml O 2 درهم واسعة شريط مغناطيسي.
- مكان قرص الستايروفوم في الدورق فقط فوق مستوى الماء.
- الشريحة ميزان الحرارة في حفرة صغيرة في القرص الستايروفوم. طلب الحرارة يجب أن يكون أعلى قليلا من 2 (لدرجة الحرارة درجة مئوية 34) ويحرك الطلب ينبغي ~ 5-6.
- برنامج تلفزيوني :
- إعداد برنامج تلفزيوني العقيمة وملء أنابيب 15ml 15 العقيمة مع مل 4-6 (تأكد للحفاظ على العقيمة
تقنية). - وضع أنابيب وزجاجة الأسهم على الجليد بجانب غطاء محرك السيارة.
- إعداد برنامج تلفزيوني العقيمة وملء أنابيب 15ml 15 العقيمة مع مل 4-6 (تأكد للحفاظ على العقيمة
- كربوجين :
- كسر في نصف stripette 5ml ودفعها من خلال سدادة مطاطية ، لذلك غيض من stripette هو تخرج في نهاية اسعة من السدادة.
- وضع سدادة في دورق مع 500ml 500ml 400 - O 2 درهم (النهاية من كسر stripette يجب أن تكون في O 2 درهم).
- توصيل أنبوب بشأن فتح جانب من القارورة.
- قطع رأس قبالة الطرف ماصة الأصفر وتوصيل هذا إلى نهاية الأنبوب (مع الجانب قطع يواجه الخروج).
ربط خزان كربوجين إلى غيض من stripette 5ml.
- إعداد غراء sol'n :
- * استخدم أسلوب عقيم حذرا.
- المزيج في أنبوب 50ml العقيمة.
- تصفية غراء sol'n في قارورة تفارق :
- استخدام وحدة الترشيح Steriflip ونقل إلى قارورة تفارق عبر stripette 25ml (أو مكان جديد تصفية حقنة 0.2μm على طرف حقنة 20ml المكبس ،
إزالة المكبس واستخدام stripette (25mL) لنقل كل من sol'n غراء في المحاقن. - تصفية في قارورة تفارق).
- غطاء القنينة ، أدخل محقنة معقمة من خلال ثقب في الغطاء وإرفاق تصفية حقنة معقمة 0.2μm إلى قاعدة الحقنة.
- توصيل كربوجين إلى تصفية وparafilm في هذا المكان. مكان القنينة في الستايروفوم القرص / حامل.
* يجب أن بقضيب الدقيقة المغناطيسية سوف تتحرك.
* يجب أن يكون والغاز مما يجعلها في القارورة.
* يجب أن يستقر عند درجة حرارة 34 درجة مئوية.
- استخدام وحدة الترشيح Steriflip ونقل إلى قارورة تفارق عبر stripette 25ml (أو مكان جديد تصفية حقنة 0.2μm على طرف حقنة 20ml المكبس ،
- تشريح الإعدادية :
- اعادة تشريح المجهر تحت غطاء محرك السيارة.
- وضع جميع الصكوك تشريح على رقائق الألومنيوم ، مع رش EtOH 70 ٪ ، من أجل إيقاف الزائدة وترك تحت غطاء محرك السيارة لتجف.
- إعداد المتوسطة العصبية :
- ترك 30ml المتوسط العصبية الطازجة في الحاضنة.
- وضع 1 مربع كبير من رقائق الألومنيوم ، و 12 مربعات صغيرة. مغادرة مقص قطع الرأس مع رقائق الألومنيوم. ملء مربع الستايروفوم صغيرة مع الماء المثلج وترك كل خارج غطاء محرك السيارة.
- الإعدادية للتخدير (الكيتامين 0.075ml وxzylazine 0.075ml).
- الحصول على ما لا يقل عن 12 الجراء (P0 - P2) لمدة 100 لوحات. بالنسبة للفئران ، تأكد من وجود مباراة في التركيب الوراثي للالقمامة بأكمله. إذا كان النمط الجيني غير معروف ، لوحة من كل الخلايا الجرو على طبق منفصل ، والحفاظ على سجلات دقيقة لأعداد الماوس ومطابقتها مع أطباق خلية ثقافة والتأكد من الخلفية الجينية للالركيزة الدبقية هو موحد عبر الثقافات الخلية.
2) تشريح
- تخدير الحيوانات الأول مع حقن داخل الصفاق. عندما يظهر التخدير والحيوان لا يستجيب لاختبار الذيل نفض الغبار ؛ وضعه في الثلج لمدة 30 ثانية (حتى تبريدي). شطف one رقائق الألومنيوم مربع صغير ، decapمقص itation ، والرأس مع EtOH 70 ٪.
- قطع رأس ، والسماح لرأس مربع تقع على رقائق الألومنيوم وتتحرك تحت غطاء محرك السيارة. إزالة بلطف الدماغ في أنبوب 15ml من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني. وضع أنبوب مرة أخرى على الجليد بينما يزيل المخ المقبل.
- كرر هذه الخطوات الأولى وحتى هناك 3 العقول على الجليد. صب جميع العقول (3) وبرنامج تلفزيوني على طبق تشريح الأول تحت المجهر. إزالة الجزء المناسب من الدماغ (VTA) واستخدام الماصة نقل لوضع شرائح في sol'n غراء. بدء الموقت عندما تذهب فيها شرائح first
- كرر الخطوات السابقة 3 حتى يتم هضم جميع العقول في غراء. وينبغي أن متوسط الوقت لهضم هو 2 ساعة. وسيكون قد تم شرائح لأول مرة في حوالي 1 ساعة من الوقت الذي يذهب فيه منها مشاركة
محاولة تقسيم الفرق. - * أثناء عملية الهضم :
- تأكد من أن درجة الحرارة في الحمام هي 34 درجة مئوية.
- قد شرائح التمسك بقضيب في البداية ، ولكن ينبغي أن تنتشر مع مرور الوقت. اذا لم يفعلوا ذلك ، اضغط على الجزء السفلي من القارورة.
3) سحن :
- باستخدام ماصة نقل ، ونقل شرائح الدماغ لأنبوب 15ml العقيمة (في محاولة لتجنب زيادة sol'n غراء) وغسلها 3 مرات مع 2ml المتوسطة الدبقية تحسنت من الحاضنة. بعد وضع وسائل الإعلام الدبقية في الأنبوب ، والسماح لتسوية شرائح ثم إزالة بعناية كما sol'n أكبر قدر ممكن من دون إزعاج القطع. تغيير ماصات لتجنب التلوث!
** لا تبقي على sol'n التي يتم إزالتها. - باستخدام ماصة نقل جديدة تبدأ في triturations 2ml من وسائل الإعلام الدبقية. متمزج 25 مرة (تجنب ترك في فقاعات الهواء) والسماح للأنبوب الجلوس لمدة 3 دقائق حتى شرائح undissociated تسوية. استخدام ماصة لإزالة ونقل KEEP sol'n أكبر قدر ممكن من دون إزعاج شرائح في القاع. إبقاء طاف في أنبوب (العقيمة) 15M جديدة.
- كرر الخطوة السابقة باستخدام ماصة 1000μl وماصة 200μl حتى ينفصل تماما.
- متمزج 10 مرات مع ماصة نقل ، أو حتى يتم معلق تماما الخلايا في sol'n.
خلايا التصفيحات 4)
- باستخدام ماصة معقمة غيض الصفراء التي تغطي كل غيض من ملقط ، أنزل بعناية حلقة الشريحة كما تركز على الزجاج وكذلك ممكن داخل كل طبق.
- وضع 10μl من الحل الخلية على عدادة الكريات والعد. (استبعاد الجماهير غير المرغوب فيه).
- مضاعفة عدد الخلايا بنسبة 10. هذا هو عدد الخلايا / ميكرولتر. 1،000،000-1،500،000 الفجوة (أو الكثافة المطلوب) من هذا العدد. هذا هو عدد ميكرولتر إضافة لكل طبق.
- استخدام غيض ماصة لحلقات الانزلاق على البئر في وسط كل طبق وقمت بإضافة ميكرولتر المناسبة / الطبق. لوحة التبديل منهم بلطف ونصائح عن كل طبق.
- إضافة 100μl (من المخفف) GDNF sol'n داخل حلقة الانزلاق في كل طبق.
- في هذا الوقت ، وضع الصواني في الحاضنة وتقديم المتوسطة العصبية في غرفة باردة.
- يسمح للخلايا لتسوية بين عشية وضحاها.
- في اليوم التالي : حلقات إزالة (باستخدام ماصة معقمة جديدة نصائح تغطي نصائح ملقط لكل طبق)
5) تثبيط الإنقسامية : في اليوم التالي
- تمييع aliquots FDU 1:10 من الأسهم 1000X بإضافة 200μl FDU الأسهم إلى 1.8 مل MEM العقيمة.
- إضافة 20μl المخفف FDU sol'n الى الحلبة خارج كل طبق. تغيير ماصة نصائح كثير من الأحيان. تغطية والعودة إلى الحاضنة.
* الإزعاج الأطباق أقل قدر ممكن خلال الايام القادمة 70-10. تحقق من وجود الأطباق المصابين وإزالة أي أطباق المصابة في البوادر الأولى للعدوى. ثقافات مستعدون للاختبار في غضون 3 أسابيع.
MEDIA / SOLUTIONS
العصبية متوسطة
(ل200mL)
** أفضل إذا كان مشروطا من قوارير الدبقية بين عشية وضحاها قبل استخدامها ليغسل / سحن
| عنصر | مبلغ | تلاحظ |
| BSA 5 ٪ | 0.5 غرام | جزء الخامس |
| MEM السائل | 94.0 مل | سيغما |
| DMEM السائل | 80.0 مل | سيغما |
| F - 12 السائل | 20.0 مل | سيغما |
| السائل الجلوكوز 45 ٪ | 1.50 مل | سيغما الحل |
| الجلوتامين 200MM | 0.5 مل | Aliquotted سيغما الحل |
| Diporzio اضرب. | 2.0 مل | سيغما الحل |
| السائل كتالاز | 0.1 مل | |
| Kynurenic حمض 0.5M | 200μl | في 1N هيدروكسيد الصوديوم |
| HCL 5N | 50 ميكرولتر |
- الجمع بين المكونات (BSA يذهب السابق) في 250mلتر زجاجة بلاستيكية.
- التصفية ، والتسمية ، والثلاجة.
Kynurenic حمض
(FW = 189.2)
0.5M = 94.6mg/ml
جعل الأسهم 8ml : 756.8mgKA/8ml 1N هيدروكسيد الصوديوم وماصة في aliquots العقيمة 200μl
DiPorzio الإعلام
أ) DiPorzio اضرب. الأسهم :
| NEED | ضم | Alliquot | ||||||
| المضافة | مذيب | أنبوب | مبلغ | مل | مل / أنبوب | اضرب. | مبلغ | # عليق. |
| الأنسولين | 20mM HCL (1) | البلاستيك | 250mg زجاجة | 10 | 1 | 25mg/ml | 25mg | 10 |
| ترانسفيرين | وهانك | 500mg زجاجة | 5 | 1 | 100mg/ml | 100mg | 5 | |
| SOD | وهانك | 70mg زجاجة | 14 | 1 | 5mg/ml | 5mg | 14 | |
| بوتريسين | وهانك | 50mg | 3 | 0.12 | 20mg/ml | 2.4mg | 21 | |
| غ 2 3 سيو | وهانك | 0.104mg | 10 | 0.5 | 10μg/ml | 5.2μg | 20 | |
| T3 | 10MM هيدروكسيد الصوديوم | 2mg | 10 | 0.1 | 0.20mg/ml | 0mg | 100 | |
| البروجسترون | 100 ٪ EtOH | زجاج | 12.5mg | 10 | 0.05 | 1.25mg/ml | استخدام الماصة | |
| الكورتيزول | 100 ٪ EtOH | زجاج | 20mg | 10 | 0.02 | 2.00mg / مل | استخدام الماصة | |
- 20mM حمض الهيدروكلوريك = 41.5μl اضرب. HCl/25ml.
- جعل الأسهم 1mg/ml وإضافة إلى 104μl 10ML.
B) DiPorzio الإعلام المتوفرة :
| المضافة | المبلغ (مل) | المبلغ (مل) X2 | اضرب النهائي. ميكروغرام / مل | اضرب النهائي. Molarity |
| البروجسترون | 0.05 | 0.1 | 0.06 | 200nM |
| الكورتيزول | 0.02 | 0.04 | 0.04 | 125nM |
| هانك وBSS | 6.21 | 12.42 | ||
| الأنسولين | 1 | 2 | 25 | |
| غ 2 3 سيو | 0.5 | 1 | 0.01 | 30nM |
| T3 | 0.1 | 0.2 | 0.02 | 30nM |
| SOD | 1 | 2 | 5 | |
| بوتريسين | 0.12 | 0.24 | 2.4 | 15nM |
| ترانسفيرين | 1 | 2 | 100 |
- استخدام أنبوب polyproylene 15ml العقيمة لإضافة هرمون البروجسترون ، والكورتيزول. استخدام الماصة الشافطة والفراغ إلى سرعة تبخر EtOH : (استخدام stripette 5ml كسر في مكان ونصف في منتصف الطريق إلى أسفل داخل أنبوب يجري حريصا جدا على ألا نضح EtOH السائل امسك الماصة في مكان آمن مع Kimwipes ثم جعل الحافة. وصولا الى علامة 500μl يقع على جانب الأنبوب.
- إضافة aliquots اللاحقة في ترتيب ظهورها على الرسم البياني أعلاه.
- بعد إضافة الأنسولين ، الأمر الذي يجعل غائم sol'n ، إضافة 20μl من هيدروكسيد الصوديوم 1N لتحييد الحموضة. وينبغي أن تذهب Sol'n من الأصفر إلى الوردي واضحة على الفور. أيضا ، بعد إضافة ترانسفيرين ، إضافة 20μl فورا من هيدروكسيد الصوديوم 1N ، لتحييد الحموضة ومنع تكوين الرواسب.
- وضع 10ML الى الماصة المصلية وتقسيمها إلى 5 aliquots (دفعة واحدة).
- @ تخزين -20 درجة مئوية.
- 2 قد تجعل دفعات في وقت واحد.
تفارق وسائل الإعلام
ألف غراء (ل1 فيال) :
** تحضير يوم طلي الحق قبل تشريح.
| عنصر | المبلغ </ قوي> | (الملاحظات) اضرب النهائي. |
| السيستين المياه | 7.8mL | 1MM السيستين |
| غراء | يختلف (* 190μl للزجاجة 44.0mg/ml) | 20 وحدة / مل (400 وحدة إجمالي لتبلغ قيمتها 20ml من sol'n) |
| H & B اضرب. | 2mL | |
| كربوجين | 95 ٪ + O2 CO2 5 ٪ | |
| حمض الهيدروكلوريك 5N | 10μl | |
| أحمر الفينول 0.5 ٪ | 20μl | 0.001 ٪ |
| Kynurenate 0.5M | 10μl | (في 1N هيدروكسيد الصوديوم) 0.5mM |
- غراء إضافة إلى الماء السيستين الأولى.
- إضافة اضرب H & B. ، kynurenate ، حمض الهيدروكلوريك ، وأحمر الفينول.
- تصفية في قارورة تفارق (كما هو موضح في الاتجاهات المحددة متابعة) والاتصال كربوجين.
B. H & B مركزة (100ML من 5X) :
| المكونات | ميغاواط | Powder/50ml H 2 O | اضرب. (M) | الجمع بين (مل) | اضرب النهائي. (ملم) |
| كلوريد الصوديوم | 58.44 | 11.699 ز | 4 | 14.5 | 116 |
| بوكل | 74.56 | 3،728 ز | 1 | 2.7 | 5.4 |
| NaHCO 3 | 84.01 | 4.2 غرام | 1 | 13 | 26 |
| ناه 2 ص 4 * H 2 O | 137.99 | 6.90 ز | 1 | 1 | 2 |
| MgSO 4 | 120.38 | 6،019 ز | 1 | 0.5 | 1 |
| EDTA (ED2 - SS) | 292 | سيغما 5 ٪ (جعل 5g/100ml الأسهم) | 0،134 | 0.3722 | 0.5 |
| جلوكوز | 180 | سيغما 45 ٪ | 2.5 | 5 | 25 |
| TC H 2 O | 62.93 |
- تجمع كميات المخزون من الحلول.
- الفجوة في aliquots 4ml.
- إضافة إلى المياه قسامة السيستين بعد إضافة غراء.
جيم المياه سيستين (157.5ml من 1X) :
| المكونات | ميغاواط | مكونات مسحوق (ملغ) | H 2 O (مل) | اضرب الأسهم (ملم) | الجمع بين (مل) | اضرب النهائي. (ملم) |
| CaCl 2 | 147.2 | 736 | 10 | 500 | 0.6 | 1.9mM |
| السيستين | 121.7 | (1.5) | 24 | 20mM (0.02M) | 10 | 1.27mM (0.88) |
| TC المياه | 146.9 |
- جعل والحفاظ على المخزون من sol'n CaCl2 0.5M عند 4 درجة مئوية
- جعل sol'n استخدام واحدة من السيستين وتتحد مع غيرها من المكونات
- تقسيمها إلى 10 aliquots من 15.75 مل وتخزينها في 4 درجات مئوية
إعداد GDNF
- قسامة الإعدادية :
- حل عقيم ، مجفف بالتجميد من بيليه GDNF 5μg مع 2.4mL من الماء منزوع الأيونات معقمة. تركيز هذا 2.08μg/mL GDNF = sol'n.
- توزيع GDNF 2.08μg/mL sol'n في 76.9μl aliquots في cryovials العقيمة. هذا 160ng = في القارورة.
- المحل في -20 درجة مئوية.
- بالإضافة إلى الثقافات :
- أذاب 1 قسامة لكل أطباق 8.
- تمييع قسامة بإضافة 723.1μl العصبية وسائل الاعلام / قسامة. وهذا جعل من sol'n GDNF 160ng/800μl.
- إضافة 100μl هذا sol'n إلى 2mL المتوسطة في كل طبق لتركيز النهائي من GDNF 10ng لكل مليلتر.
إعداد FDU
FDU - 1000X sol'n ألبوم :
| عنصر | مبلغ | (الملاحظات) اضرب النهائي. |
| يوريدين | 247 ملغ | 16.5 ملغ / مل |
| 5 - FDU (5 - fluorodeoxyuridine) | 100 ملغ (زجاجة) | 6.7 ملغ / مل |
| TC المياه | 15 مل |
- جعل ما يزيد قليلا على 15 مل من يوريدين ملغ / مل 16.5.
- إضافة 15 مل يوريدين sol'n إلى 100 ملغ من زجاجة FDU جعل 6،7 ملغ / مل FDU sol'n.
- الفجوة في aliquots 200μl وتجميد -20 درجة مئوية.
تمييع للاستخدام :
- تمنع نمو الخلايا العصبية غير الخلايا. 01:10 تمييع الأسهم 1000X بإضافة الأسهم 200μl إلى MEM مل 1.8.
- إضافة 20μl FDU المخفف الى الحلبة خارج كل طبق. تغيير نصائح الماصة في كثير من الأحيان. تغطية والعودة إلى الحاضنة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وصفت وسائل تسمح للقرار هنا غرامة من الميزات المورفولوجية والكيميائية العصبية الدوبامين من الخلايا العصبية المركزية التي هي على خلاف ذلك غير متوفرة في نهج النظامية أو في الجسم الحي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
وكان يؤيد العمل DK065872 (ENP) ، ومؤسسة عائلة سميث جائزة التميز في البحوث الطبية الحيوية (ENP) ، F31 DA023760 (BMG ، ENP) وP30 NS047243 (تافتس مركز أبحاث العلوم العصبية).
Materials
| Materials are included in the protocol text. |
References
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
- Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
- Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).
