Primaire los middenhersenen Dopamine celculturen van knaagdieren pasgeborenen

Summary

Primaire los middenhersenen dopamine celculturen zorgen voor de studie van de presynaptische kenmerken van dopamine neuronen. Ze kunnen worden gebruikt om real-time dopamine-afgifte kinetiek en een eiwitfractie / mRNA niveaus van de regulatoren van dopamine exocytose monitor. Hier tonen we u hoe u deze culturen genereren uit knaagdier pasgeborenen.

Abstract

De mogelijkheid om primaire celculturen van dopamine neuronen te creëren zorgt voor de studie van de presynaptische kenmerken van dopamine neuronen geïsoleerd van de systemische input van elders in de hersenen. In ons lab, gebruiken we deze neuronen aan dopamine vrijgavekinetiek met behulp van koolstof vezel amperometrie, alsook expressie van dopamine verwante genen en eiwitten met behulp van kwantitatieve PCR en immunocytochemie te beoordelen. In deze video laten we u zien hoe we deze culturen genereren op basis van knaagdieren pasgeborenen.

Het proces omvat een aantal stappen, waaronder de beplating van de corticale gliale astrocyten, de conditionering van neuronale cel-cultuur media door de gliale substraat, de ontleding van de middenhersenen bij pasgeborenen, de spijsvertering, extractie en plating van dopamine neuronen en de toevoeging van neurotrofe factoren om zorgen voor overleving van de cel.

De applicaties die geschikt zijn voor een dergelijk preparaat onder de elektrofysiologie, immunocytochemie, kwantitatieve PCR, video microscopie (dat wil zeggen, van real-time vesiculaire fusie met de plasmamembraan), levensvatbaarheid van de cellen assays en andere toxicologische schermen.

Protocol

Voorbereiding Voorafgaand aan de Cultuur

Let op: ** gliacellen moeten goed worden uitgeplaat op voorhand, zodat ze tijd hebben om te woekeren en bedek de bodem van de gerechten. Voor muizen met atypische of experimentele genetische achtergrond, zorg ervoor om gliale en neuronale culturen wedstrijd in termen van genotype.

Let op: ** 1-7 dagen vóór versnijding, bereiden verse neuronale medium en vervang de gliale medium in de gerechten met 2ml.

Let op: ** Op de dag voor dissectie, de volgende items dienen te worden gelaten onder UV-licht 's nachts:

• 4 dissectie platen
• 2 dissociatie flacons met een micro-magnetische roerstaaf
• 2 afwipdopjes (met 2 kleine gaatjes prikte in de top)
• Verspreid glijringen (en vacht in 70% EtOH) - het vak ook open
• MINSTENS twee volle dozen met gele (10-200μl) pipettips
• Een doos van blauw (100-1000μl) pipettips

Dag van Cultuur

Opmerking: * ZEKER NIET om iets wat uit LINKS overnachting voor UV TOUCH!

Het handhaven van een steriele omgeving onder de motorkap is erg belangrijk.

1) Set Up:

Let op: ** Leg bevroren ingrediënten om papaïne oplossing te maken.

1. Schoon pincet met 70% EtOH. Bedek elke tip met een steriele pipet geel tip. Gebruiken om steriele glijringen plaats in hun vak.
2. Hete plaat:
   1. Plaats een mini-magnetic/hot plaat onder de kap met een 1000ml beker gevuld tot 500-600ml dH ₂ O en een grote magnetische roerstaaf.
   2. Plaats een piepschuim schijf in de beker net boven de waterspiegel.
   3. Schuif de thermometer in een klein gaatje in het piepschuim schijf. Warmte dial moet iets meer dan 2 (voor een temp van 34 ° C) en het roer dial moet worden ~ 5-6.
3. PBS:
   1. Bereid steriel PBS en vul 15 steriele 15 ml buizen met 4-6 ml (zeker te onderhouden steriel
      techniek).
   2. Plaats de buizen en de voorraad fles op ijs naast de kap.
4. Carbogen:
   1. Breek een 5 ml stripette in half en duw het door een rubberen stop, zodat het uiteinde van de stripette is steekt het brede uiteinde van de stop.
   2. Plaats de stop in een 500ml fles met 400-500ml dH ₂ O (gebroken einde van stripette moet in de dH ₂ O).
   3. Sluit een slang aan de kant opening van de kolf.
   4. Snijd de tip een geel pipetpunt en sluit deze aan het einde van de buis (met de gesneden kant naar buiten gericht).
      
      Sluit de carbogen tank aan het uiteinde van de 5ml stripette.
      
      
5. Bereid papaïne sol'n:
   1. * Gebruik een zorgvuldige steriele techniek.
   2. Meng in een steriele 50 ml buis.
6. Filter papaïne sol'n in de dissociatie flacon:
   1. Gebruik een Steriflip filtratie-eenheid en over te dragen aan dissociatie flacon 25ml via stripette (of de locatie een nieuwe 0.2μm spuitfilter op het puntje van een zuiger 20ml spuit,
      Verwijder de zuiger en gebruik een stripette (25ml) om alle van de papaïne sol'n overdracht in de spuit.
   2. Filter in de dissociatie flacon).
   3. Cap de flacon, plaatst u een steriele spuit door het gat in de dop en bevestig een steriele 0.2μm spuitfilter aan de basis van de spuit.
   4. Sluit de carbogen om de filter en parafilm dit op zijn plaats. Plaats de flacon in de piepschuim schijf / houder.
      
      * De micro-magnetische roerstaaf moet bewegen.
      * Het gas moet worden waardoor het in de flacon.
      * De temperatuur moet stabiliseren op 34 ° C.
      
      
7. Dissection prep:
   1. Breng de dissectie microscoop onder de motorkap.
   2. Leg alle dissectie-instrumenten op aluminium folie, spray met 70% EtOH, giet het overtollige en laat onder de motorkap om te drogen.
8. Bereid neuronale medium:
   1. Laat 30ml vers neuronale medium in de incubator.
9. Leg een groot vierkant van aluminiumfolie en 12 kleinere pleinen. Laat de onthoofding schaar met het aluminium folie. Vul een kleine piepschuim doos met ijswater en laat alle buitenkant van de kap.
10. Prep de anesthesie (0.075ml ketamine en 0.075ml xzylazine).
11. Krijgen ten minste 12 pups (P0-P2) voor 100 platen. Voor muizen, zorg ervoor dat er een genotype match voor de hele nest. Als genotype is onbekend, plaat-cellen van elke pup op een aparte schotel, houd nauwkeurige registratie van de muis nummers en passen ze met celkweek gerechten en zorg ervoor dat de genetische achtergrond van de gliale substraat is overal in celculturen.

2) Dissection

1. Verdoven het eerste dier met een intraperitoneale injectie. Indien dierlijke sedatie shows en niet reageert op de staart-flick test, zet het in ijs gedurende 30 seconden (tot onderkoeld). Spoel een klein aluminiumfolie plein, Decapitation schaar, en het hoofd met 70% EtOH.
2. Onthoofden, laat het hoofd vallen op aluminiumfolie plein en onder de motorkap te verplaatsen. Verwijder voorzichtig de hersenen in een 15ml tube ijskoud PBS. Plaats de buis weer op het ijs tijdens het verwijderen van de volgende hersenen.
3. Herhaal deze eerste stappen tot er 3 hersens op ijs. Giet alle 3 de hersenen en PBS op de eerste dissectie schotel onder de microscoop. Verwijder de desbetreffende gedeelte van de hersenen (VTA) en gebruik een transfer pipet om de segmenten brengen papaïne sol'n. Start een timer, toen de eerste segmenten naar binnen
4. Herhaal de vorige 3 stappen totdat alle hersenen worden verteerd in papaïne. De gemiddelde tijd voor de spijsvertering moet worden 2 uur. De eerste segmenten zal zijn geweest voor ongeveer 1 uur tegen de tijd dat de laatste die naar binnen
   
   Probeer om het verschil te splitsen.
   
   
5. * Tijdens de spijsvertering:
   1. Zorg ervoor dat de temp in het bad is 34 ° C.
   2. Segmenten kunnen vasthouden aan de roer bar op het eerste, maar moet gespreid naarmate de tijd vordert. Als ze dat niet doen, tik op de bodem van de flacon.

3) tritureren:

1. Met behulp van een overdracht pipet de hersenen segmenten om een ​​steriele 15ml buis (proberen om het overtollige papaïne sol'n te voorkomen) en was ze drie keer met 2 ml verwarmde gliale medium uit de incubator. Nadat hij de gliale media in de buis, laat segmenten om zich te vestigen en vervolgens verwijder voorzichtig zoveel sol'n mogelijk zonder verstoring van de segmenten. Verandering pipetten om besmetting te voorkomen!
   
   ** Hier niet aan houden de sol'n die is verwijderd.
   
   
2. Met behulp van een frisse transferpipet beginnen verwrijvingen in 2 ml van gliale media. Vermaal 25 keer (vermijden dat in luchtbellen) en laat de buis zitten voor 3 minuten tot ongedissocieerde segmenten af ​​te wikkelen. Gebruik een transfer pipet te verwijderen en zo veel sol'n houden als mogelijk is zonder storende segmenten aan de onderkant. Houd de bovenstaande vloeistof in een nieuwe (steriele) 15m buis.
3. Herhaal de vorige stap met behulp van een pipet en 1000μl 200μl pipet tot volledig gescheiden.
4. Vermaal 10 keer met een transfer pipet, of tot de cellen volledig geresuspendeerd in sol'n.

4) Plating Cellen

1. Met behulp van een steriele geel pipet tip met betrekking tot elk punt van de pincet voorzichtig laten vallen een dia ring als het midden op het glas zo goed mogelijk in elk gerecht.
2. Doe 10μl van de cel oplossing op de hemacytometer en rekenen. (Uitsluiten junk massa).
3. Vermenigvuldig het aantal cellen met 10. Dit is het aantal cellen / ul. Verdeel 1,000,000-1,500,000 (of gewenste dichtheid) van dit nummer. Dit is het aantal van de ui toe te voegen per gerecht.
4. Gebruik de pipet tip om ringen glijden over het centrum-well van elk gerecht als je toevoegt juiste pl / schotel. Plaat ze zachtjes en wissel tips voor elk gerecht.
5. Voeg 100μl (van verdund) GDNF sol'n in de schuif ring van elk gerecht.
6. Op dit moment, plaats de laden in de incubator en breng de neuronale medium in de koude kamer.
7. Laat cellen om zich te vestigen 's nachts.
8. Volgende dag: verwijder ringen (met behulp van nieuwe steriele pipet tips met betrekking tot de forceps tips voor elk gerecht)
   

5) Mitotische Inhibitie: DE VOLGENDE DAG

1. Verdunnen FDU hoeveelheden van 1000X voorraad 01:10 door het toevoegen van 200μl FDU voorraad met 1,8 ml steriel MEM.
2. Voeg 20μl verdund FDU sol'n aan de buitenste ring van elk gerecht. Vaak veranderen pipetpunten. Te dekken en terug te keren naar de incubator.
   
   * Disturb de gerechten zo weinig mogelijk voor de komende 7-10 dagen. Controleren op besmette borden en verwijder alle geïnfecteerde gerechten bij de eerste tekenen van infectie. Culturen zijn klaar voor het testen binnen 3 weken.

MEDIA / OPLOSSINGEN

Neuronale Medium

(Voor 200ml)

** Beste indien de voorwaarde dat glia van kolven 's nachts voor het gebruik voor het wassen / tritureren

Bestanddeel	Aantal	Opmerkingen
BSA 5%	0,5 g	Fraction V
MEM vloeistof	94,0 ml	Sigma
DMEM vloeistof	80,0 ml	Sigma
F-12 vloeistof	20,0 ml	Sigma
Glucose 45% vloeibare	1,50 ml	Sigma-oplossing
Glutamine 200MM	0,5 ml	Aliquotted Sigma oplossing
Diporzio Conc.	2,0 ml	Sigma-oplossing
Vloeistof Catalase	0,1 ml
Kynurenic zuur 0,5 M	200μl	In 1N NaOH
HCL 5N	50 ui

1. Combineer ingrediënten (BSA gaat laatste) in een 250ml plastic fles.
2. Filter, label, en in de koelkast.

Kynurenic Acid
(FW = 189,2)
0,5 M = 94.6mg/ml
Maak 8ml voorraad: 756.8mgKA/8ml NaOH 1 N en pipet in steriele monsters van 200μl

DiPorzio Media

A) DiPorzio Conc. Voorraden:

NODIG			Combineren			Alliquot
Toevoeging	Solvent	Buis	Aantal	ml	ml / tube	Conc.	Aantal	# Aliq.
Insuline	20mm HCL (1)	plastic	250mg fles	10	1	25mg/ml	25mg	10
Transferrine	Hank's		500mg fles	5	1	100mg/ml	100mg	5
SOD	Hank's		70mg fles	14	1	5mg/ml	5mg	14
Putrescine	Hank's		50mg	3	0.12	20mg/ml	2.4mg	21
Na twee SeO 3	Hank's		0.104mg	10	0.5	10μg/ml	5.2μg	20
T3	10 mM NaOH		2 mg	10	0.1	0.20mg/ml	0mg	100
Progesteron	100% EtOH	Glas	12,5	10	0.05	1.25mg/ml	Gebruik pipet
Cortisol	100% EtOH	Glas	20mg	10	0.02	2.00mg / ml	Gebruik pipet

1. 20MM HCl = 41.5μl conc. HCl/25ml.
2. Maak 1mg/ml bouillon en voeg 104μl naar 10ml.

B) DiPorzio Media Stock:

Toevoeging	Hoeveelheid (ml)	Hoeveelheid (ml) X2	Final Conc. ug / ml	Final Conc. Molariteit
Progesteron	0.05	0.1	0.06	200nm
Cortisol	0.02	0.04	0.04	125nM
Hank's BSS	6.21	12,42
Insuline	1	2	25
Na twee SeO 3	0.5	1	0.01	30 nm
T3	0.1	0.2	0.02	30 nm
SOD	1	2	5
Putrescine	0.12	0.24	2.4	15Nm
Transferrine	1	2	100

1. Gebruik een 15 ml polypropyleen steriel buisje aan de progesteron en cortisol toe te voegen. Gebruik een aspirator pipet en vacuüm verdamping van EtOH snelheid: (gebruik een 5 ml stripette gebroken in tweeën en plaats halverwege naar beneden in de buis wordt heel voorzichtig zijn om geen EtOH vloeistof te zuigen stevig Houd pipet op zijn plaats met Kimwipes en breng de tip. tot aan de 500μl markering aan de zijkant van de buis.
2. Voeg de volgende monsters in de volgorde waarin ze op de bovenstaande grafiek.
3. Na de toevoeging van insuline, waardoor de sol'n troebel maakt, voeg 20μl van 1N NaOH om de pH te neutraliseren. Sol'n moeten gaan van geel naar roze en meteen duidelijk. Ook na de toevoeging van transferrine, onmiddellijk aan toevoegen 20μl van 1N NaOH, om de pH te neutraliseren en de vorming van precipitaten te voorkomen.
4. Het opstellen van 10ml in een serologische pipet en verdelen in 5 monsters (een batch).
5. Store @ -20 ° C.
6. Kan twee partijen tegelijk.

Dissociatie Media

A. Papaïne (voor een flacon):

** Bereid dag in de platen vlak voor dissectie.

Bestanddeel	Bedrag </ Strong>	(Notes) Final Conc.
Cysteine ​​Water	7.8mL	1 mM cysteine
Papaïne	Varieert (* 190μl voor de fles 44.0mg/ml)	20 eenheden / ml (400 stuks in totaal voor 20 ml waarde van sol'n)
H & B conc.	2 ml
Carbogen	95% O2 + 5% CO2
HCl 5N	10μl
0,5% Fenolrood	20μl	0,001%
Kynurenate 0,5 M	10μl	(In 1N NaOH) 0.5mm

1. Voeg papaïne aan de cysteïne water FIRST.
2. Voeg de H & B conc., Kynurenate, HCl, en fenol rood.
3. Filter in dissociatie flacon (zoals beschreven in de set-up richtingen) en maak verbinding met de carbogen.
   

B. H & B Concentrate (100ml van 5X):

Ingrediënten	MW	Powder/50ml H 2 O	Conc. (M)	Combineer (ml)	Final Conc. (MM)
NaCl	58,44	11.699 g	4	14,5	116
KCl	74,56	3,728 g	1	2.7	5.4
NaHCO 3	84,01	4,2 g	1	13	26
NaH 2 PO 4 * H 2 O	137,99	6,90 g	1	1	2
MgSO 4	120,38	6,019 g	1	0.5	1
EDTA (ED2-SS)	292	Sigma 5% (te maken 5g/100ml voorraad)	0.134	0.3722	0.5
Glucose	180	Sigma 45%	2.5	5	25
TC H 2 O				62,93

1. Combineer hoeveelheden uit voorraad oplossingen.
2. Verdeel het deeg in 4 ml porties.
3. Voeg hoeveelheid aan cysteïne water na toevoeging van papaïne.
   

C. Cysteïne Water (157.5ml van 1X):

Ingrediënten	MW	Componenten Poeder (mg)	H 2 O (ml)	Stock Conc. (MM)	Combineer (ml)	Final Conc. (MM)
CaCl 2	147,2	736	10	500	0.6	1.9mM
Cysteine	121,7	(1.5)	24	20mm (0,02 miljoen)	10	1.27mm (0.88)
TC water					146,9

1. Maken en houden een voorraad van 0,5 M CaCl2 sol'n bij 4 ° C
2. Maak een een gebruik sol'n van cysteïne en combineren met andere ingrediënten
3. Verdeel het deeg in 10 porties van 15,75 ml en bewaar bij 4 ° C
   

GDNF Voorbereiding

1. Aliquot prep:
   1. Los steriele, gevriesdroogde pellet van 5μg GDNF met 2,4 ml van steriel gedemineraliseerd water. De concentratie van deze GDNF sol'n = 2.08μg/mL.
   2. Verdeel de 2.08μg/mL GDNF sol'n in 76.9μl porties in een steriele cryovials. Dit = 160ng per flacon.
   3. Bewaren bij -20 ° C.
2. Toevoeging aan culturen:
   1. Dooi een aliquot voor elke acht gerechten.
   2. Verdun aliquot door het toevoegen van 723.1μl neuronale media / aliquot deel. Dit zal een sol'n van 160ng/800μl GDNF.
   3. Voeg 100μl van deze sol'n om de 2 ml van het medium in elk gerecht voor een uiteindelijke concentratie van 10ng GDNF per ml.
      

FDU Voorbereiding

FDU-sol'n 1000X Voorraad:

Bestanddeel	Aantal	(Notes) Final Conc.
Uridine	247 mg	16,5 mg / ml
5-FDU (5-fluorodeoxyuridine)	100 mg (fles)	6,7 mg / ml
TC Water	15 ml

1. Maak een iets meer dan 15 ml 16,5 mg / ml uridine.
2. Voeg 15 ml uridine sol'n tot 100 mg fles FDU tot 6,7 mg / ml sol'n FDU te maken.
3. Verdeel het deeg in porties 200μl en invriezen tot -20 ° C.

Verdunnen voor gebruik:

1. Remmen de groei van niet-neuronale cellen. Verdunnen 1000X voorraad 01:10 door het toevoegen van 200μl voorraad tot 1,8 ml MEM.
2. Voeg 20μl verdund FDU aan de buitenste ring van elk gerecht. Vaak veranderen pipet tips. Te dekken en terug te keren naar de incubator.

Discussion

De hier beschreven methoden zorgen voor prima resolutie van morfologische en neurochemische kenmerken van centrale dopamine neuronen die anders niet beschikbaar zijn in een systemische of in vivo benadering.

Materials

Materials are included in the protocol text.