Summary
기본 dissociated midbrain의 도파민 세포 문화는 도파민 뉴런의 presynaptic 특성의 연구 수 있습니다. 그들은 실시간 도파민 릴리스 속도론 및 단백질 / mRNA 도파민 exocytosis의 규제 수준을 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다. 여기, 우리는 당신이 쥐 neonates에서 이러한 문화를 생성하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
도파민 뉴런의 기본 셀 문화를 만드는 능력은 다른 두뇌에서 가장 체계적인 입력으로부터 격리되어 도파민 뉴런의 presynaptic 특성의 연구 있습니다. 우리가 실험실에서, 우리는 탄소 섬유 amperometry뿐만 아니라 양적 PCR과 immunocytochemistry를 사용하여 도파민 관련 유전자와 단백질의 표현 수준을 사용하는 도파민 릴리스 속도론을 평가하기 위해 이러한 뉴런을 사용합니다. 우리가 쥐 neonates에서 이러한 문화를 생성하는 방법이 비디오에서는, 우리는 당신을 보여줍니다.
이 과정은 대뇌 피질 glial astrocytes의 도금, glial 기판으로의 연결을 세포 배양 미디어의 시설, neonates에 midbrain의 해부, 소화, 추출 및 도파민 뉴런의 도금 및 neurotrophic 요인 외에 포함한 여러 단계를 포함 세포 생존을 보장합니다.
이러한 준비에 적합 응용 프로그램은 전기 생리학, immunocytochemistry, 정량 PCR, 비디오 현미경 (즉, 플라즈마 막과 함께 실시간으로 기공을 갖는 융합의), 세포 생존 능력의 assays 및 기타 toxicological 화면을 포함합니다.
Protocol
문화를 이전 준비
참고 : 그들은 세포 분열 따위에 의해 번식과 요리의 바닥을 커버하는 시간을 갖도록 ** Glial 세포가 사전에 잘 도금해야합니다. 비정형 또는 실험 유전 배경과 마우스의 경우, 유전자형의 관점에서 glial와의 연결을 문화와 일치해야합니다.
참고 : ** 1~7일 해부하기 전에, 신선의 연결 매체를 준비하고 2ml와 요리에 glial 매체를 대체합니다.
참고 : ** 해부 전날에 다음과 같은 항목이 하룻밤 사이에 자외선 아래에서 왼쪽으로해야합니다 :
- 4 해부 접시
- 마이크로 자석 저어 바 2 해리의 튜브
- 이 유리 뚜껑 (2 작은 구멍 위쪽에 찌르고 포함)
- 슬라이드 고리 (그리고 70% EtOH의 겉옷)을 벌리고 - 상자도 열어두고
- 노란색 (10 - 200μl) 피펫 팁 최소한 2 전체 박스
- 블루 1 박스 (100 1000μl) 피펫 팁
문화의 날
참고 : * 숙박 자외선을 위해 남아 있던 아무것도 만지지하지 않도록!
후드 아래 멸균 환경을 유지하는 것은 매우 중요합니다.
1) 설정 :
참고 : ** papain 솔루션을 만들기 위해 모든 냉동 재료가 옆으로 설정합니다.
- 70 % EtOH로 청소 포셉. 멸균 노란색 pipet 팁 각 제보를 커버. 자신의 상자에서 무균 슬라이드 반지를 게재할 수 있습니다.
- 핫 플레이트 :
- 500 600ml DH 2 O와 큰 자기 저어 표시줄에 채워 1000ml 비커와 후드 아래 mini-magnetic/hot 접시를 놓습니다.
- 그냥 수위 위의 비커에 스티로폼 디스크를 넣으십시오.
- 스티로폼 디스크에있는 작은 구멍에 온도계를 슬라이드. 약간이 위에 수 (34 ° C의 임시직)과 교도소 다이얼은 ~ 5-6되어야 히트 다이얼해야합니다.
- PBS :
- 멸균 PBS를 준비하고 (무균 유지하기 위해 반드시 4-6 ML로 15 살균 15ml 튜브를 기입
기술). - 후드 옆에 얼음 튜브 및 재고 병을를 놓습니다.
- 멸균 PBS를 준비하고 (무균 유지하기 위해 반드시 4-6 ML로 15 살균 15ml 튜브를 기입
- Carbogen :
- 반으로 5ml stripette 브레이크와 고무 마개를 통해 밀어 stripette의 끝 마개의 다양한 최종 확 튀어나와 보이게하는 것입니다.
- 400 500ml DH 2 O (stripette의 부러진 끝이 DH 2 O에 있어야합니다)를 500ml 플라스크에 마개를 놓습니다.
- 술병의 측면 개방에 튜브를 연결합니다.
- 노란색 피펫 팁 해제 팁을 잘라 튜브의 끝 부분 (밖으로 직면하고있는 컷 측면과 함께) 이것을 연결합니다.
5ml stripette 끝에 carbogen 탱크를 연결합니다.
- papain sol'n 준비 :
- *주의 멸균 기술을 사용합니다.
- 멸균 50ml 튜브에 섞는다.
- 분리의 약병에 필터 papain sol'n :
- 25ml stripette (장소 20ml 플런저 주사기의 끝에 새로운 0.2μm 주사기 필터를 통해 Steriflip 여과 장치와 분리의 약병에 전송을 사용하여
플런저를 제거하고 주사기로 papain의 sol'n의 모든 전송 stripette (25mL)를 사용합니다. - ) 분리의 약병에 필터.
- , 병을 뚜껑 뚜껑에있는 구멍을 통해 멸균 주사기를 삽입하고 주사기의 기지에 멸균 주사기 0.2μm 필터를 첨부합니다.
- 필터 및 parafilm이 곳으로 carbogen를 연결합니다. 스티로폼 디스크 / 홀더에서 병을를 놓습니다.
* 마이크로 자석 저어 막대가 이동해야합니다.
* 가스 유리병으로 만드는해야합니다.
* 온도가 34에서 안정해야 ° C.
- 25ml stripette (장소 20ml 플런저 주사기의 끝에 새로운 0.2μm 주사기 필터를 통해 Steriflip 여과 장치와 분리의 약병에 전송을 사용하여
- 해부의 준비 :
- 후드 아래 해부 현미경을 가져와.
- 알루미늄 호일에있는 모든 해부 장비를 배치 70 % EtOH로 스프레이, 초과를 부어 건조하는 후드 아래에 둡니다.
- 의 연결 매체 준비 :
- 인큐베이터에 신선한의 연결 매체 30ml 둡니다.
- 알루미늄 호일 1 큰 사각형 12 작은 정사각형을 배치. 알루미늄 호일로 잘린 가위를 남겨주세요. 얼음물과 함께 작은 스티로폼 상자를 기입하고 후드의 모든 밖으로 두십시오.
- 준비 마취 (0.075ml 마취제 및 0.075ml xzylazine).
- 100 접시를위한 최소한 12 새끼 (P0 - P2)를하십시오. 생쥐의 경우 전체 쓰레기의 유전자형의 일치가 있는지 확인하십시오. 유전자형이 알 수없는 경우, 별도의 접시에있는 각 펍에서 판 세포는, 마우스 번호의 정확한 기록을 유지하고 그들과 일치하는 세포 배양 요리와 glial 기판의 유전 배경 셀 문화에 걸쳐 균일 있는지 확인하십시오.
2) 해부
- intraperitoneal 주사와 함께 최초의 동물을 마취. 동물 진정 작용을 보여줍니다 및 꼬리 - 영화 테스트에 응답하지 않는 경우, 30초 (저체온증까지)를위한 얼음에 넣어. 작은 알루미늄 호일 스퀘어, decap 린스itation 가위, 그리고 70 % EtOH로 머리.
- 목을 베다, 머리를 알루미늄 호일 광장에 가을과 후드에 따라 이동할 수 있습니다. 부드럽게 얼음처럼 차가운 PBS의 15ml 튜브에 머리를 제거합니다. 다음 머리를 제거하는 동안 다시 얼음 튜브를 놓습니다.
- 얼음 3 두뇌가되기 전까지는이 첫 단계를 반복합니다. 현미경으로 최초의 해부 접시에 3 개의 머리와 PBS 하거라. 두뇌의 적절한 섹션 (VTA)를 제거하고 papain sol'n에 세그먼트를 넣어 전송 pipet을 사용합니다. 첫 번째 세그먼트가 들어가면 타이머를 시작합니다
- 모든 머리가 papain으로 소화되고 때까지 이전 3 단계를 반복합니다. 소화에 대한 평균 시간은 2 시간해야합니다. 첫 번째 세그먼트는 마지막 사람이 들어가는 시간에 의해 약 1 시간에 있었 것입니다
그 차이를 분할하려고합니다. - * 소화하는 동안 :
- 목욕에있는 임시 34 있는지 확인하십시오 ° C.
- 세그먼트 처음 저어 표시줄 스틱지만, 시간이 지남에 따라 분산해야합니다. 그들이하지 않는 경우, 유리병의 바닥을 누릅니다.
3) 분쇄 :
- 전송 피펫을 사용하여 살균 15ml 튜브 (초과 papain sol'n을 피하기 위해 시도)에 두뇌 세그먼트를 전송하고 인큐베이터에서 예열 glial 매체의 2ml와 함께 그들에게 3 번 씻으십시오. 튜브에 glial 미디어를 퍼팅 후, 세그먼트는 세그먼트를 방해하지 않고 해결하고 신중하게 가능한 한 많은 sol'n으로 제거할 수 있습니다. 오염을 피하기 위해 pipettes를 변경!
**이 제거됩니다 sol'n 보관하지 마십시오. - 새로운 전송 피펫을 사용하면 glial 미디어 2ml에 triturations을 시작합니다. 25 번 (공기 방울 들여 보내는 방지) 씹다하고 undissociated 세그먼트가 정착 때까지 튜브를 3 분 동안 앉아 보자. 하단에있는 세그먼트를 방해하지 않고 가능한 한 많은 sol'n를 제거하고 유지하는 전송 피펫을 사용합니다. 새 (살균) 15m 튜브의 표면에 뜨는 보관하십시오.
- 완전히 dissociated까지 1000μl 피펫과 피펫 200μl를 사용하여 이전 단계를 반복합니다.
- 이전 피펫 10 번 씹다, 또는 세포는 완전히 sol'n에 resuspended 때까지.
4) 도금 세포
- 포셉의 각 끝부분을 덮고 멸균 노란색 피펫 팁을 사용하여주의 깊게 각 접시 내부뿐만 아니라 가능한 한 유리에 중심 슬라이드 반지를 놓습니다.
- hemacytometer과 카운트에 셀 솔루션의 10μl 넣고. (정크 대중 제외).
- 10 세포의 수를 곱하면됩니다. 이것은 세포 / μl의 번호입니다. 이 번호로 1,000,000-1,500,000 (또는 원하는 밀도) 나누십시오. 이것은 요리 당 추가 μl의 번호입니다.
- 당신은 적절한 μl / 접시를 추가로 중심을 잘 각 접시 이상의 반지를 슬라이드에 피펫 팁을 사용합니다. 부드럽게 플레이트를 모든 요리에 대한 조언을 전환합니다.
- 100μl (희석의) 각 접시의 슬라이드 링 내부 GDNF의 sol'n를 추가합니다.
- 이때, 인큐베이터에있는 트레이를 배치하고 추운 방에의 연결 매체를 가지고.
- 세포 하룻밤 정착하도록 허용합니다.
- 그 다음날 삭제 고리 (모든 요리에 대한 포셉 도움말을 다루는 새로운 멸균 피펫 팁을 사용하여)
5) Mitotic 억제 : 다음날
- 1.8 ML 무균 멤에 200μl FDU 주식을 추가하여 1000X 재고 1시 10분의 FDU의 aliquots을 희석.
- 각 요리의 바깥 고리에 20μl 희석 FDU sol'n를 추가합니다. 자주 피펫 팁을 변경합니다. 커버 및 인큐베이터로 돌아갑니다.
* 다음 70~10일 가능한 한 작은 요리를 방해. 감염 요리를 확인하고 감염의 첫 징후에 감염된 요리를 제거합니다. 문화는 3 주 이내에 시험에 대한 준비가되어 있습니다.
미디어 / 솔루션
의 연결 매체
(200mL)을
세척 / 분쇄를위한 사용하기 전에 밤새 flasks에서 glia에 에어컨 ** 베스트 경우
| 성분 | 양 | 노트 |
| BSA 5% | 0.5 g | 분획 V |
| 멤 액체 | 94.0 ML | 시그마 |
| DMEM 액체 | 80.0 ML | 시그마 |
| F - 12 액체 | 20.0 ML | 시그마 |
| 포도당 45 % 액체 | 1.50 ML | 시그마 솔루션 |
| 글루타민 200mM | 0.5 ML | Aliquotted 시그마 솔루션 |
| Diporzio 콩크. | 2.0 ML | 시그마 솔루션 |
| 액체 카탈 라 아제 | 0.1 ML | |
| 0.5M Kynurenic 산성 | 200μl | 1N NaOH에 |
| HCL 5N | 50 μl |
- 250m에서 소재를 (BSA가 마지막으로가는) 결합내 플라스틱 병.
- 필터, 레이블 및 냉동.
Kynurenic 산성
(FW = 189.2)
0.5M = 94.6mg/ml
200μl의 멸균 aliquots에 1N NaOH 756.8mgKA/8ml 및 피펫 : 8ml 재고를 확인
DiPorzio 미디어
A) DiPorzio 콩크가. 주식 :
| 필요 | 컴바인 | Alliquot | ||||||
| 첨가물 | 용제 | 튜브 | 양 | ML | ML / 튜브 | 콩크. | 양 | # Aliq. |
| 인슐린 | 20mM HCL (1) | 플라스틱 | 250mg 병 | 10 | 1 | 25mg/ml | 25mg | 10 |
| 트랜스페린 | 행크의 | 500mg 병 | 5 | 1 | 100mg/ml | 100mg | 5 | |
| 잔디 | 행크의 | 70mg 병 | 14 | 1 | 5mg/ml | 5mg | 14 | |
| Putrescine | 행크의 | 50mg | 3 | 0.12 | 20mg/ml | 2.4mg | 21 | |
| 나이 SEO 3 | 행크의 | 0.104mg | 10 | 0.5 | 10μg/ml | 5.2μg | 20 | |
| T3 | 10mM NaOH | 2mg | 10 | 0.1 | 0.20mg/ml | 0mg | 100 | |
| Progesterone | 백퍼센트 EtOH | 유리 | 12.5mg | 10 | 0.05 | 1.25mg/ml | pipet을 사용 | |
| Cortisol | 백퍼센트 EtOH | 유리 | 20mg | 10 | 0.02 | 2.00mg / ML | pipet을 사용 | |
- 20mM HCL = 41.5μl CONC. HCl/25ml.
- 1mg/ml 재고를 만들고 10ml에 104μl 추가할 수 있습니다.
B) DiPorzio 미디어 주식 :
| 첨가물 | 금액 (ML) | 금액 (ML) X2 | 최종 콩크. μg / ML | 최종 콩크. Molarity |
| Progesterone | 0.05 | 0.1 | 0.06 | 200nM |
| Cortisol | 0.02 | 0.04 | 0.04 | 125nM |
| 행크의 BSS | 6.21 | 12.42 | ||
| 인슐린 | 1 | 2 | 25 | |
| 나이 SEO 3 | 0.5 | 1 | 0.01 | 30nM |
| T3 | 0.1 | 0.2 | 0.02 | 30nM |
| 잔디 | 1 | 2 | 5 | |
| Putrescine | 0.12 | 0.24 | 2.4 | 15nM |
| 트랜스페린 | 1 | 2 | 100 |
- progesterone과 cortisol을 추가할 15ml polyproylene 멸균 튜브를 사용하십시오. (튜브가 EtOH 액체를 대기음되지 매우 신중에 반절과 장소 절반 방식으로 세분화 5ml stripette를 사용 Kimwipes과 장소에 안전하게 pipet을 잡고 다음 팁을 가져 :. EtOH의 증발 속도를 흡인기의 pipet과 진공을 사용하여 다운 튜브의 측면에있는 500μl 표시.
- 그들이 위의 차트에 나타나는 순서에 따라 후속 aliquots을 추가합니다.
- sol'n의 뿌연하게 인슐린의 추가 후, 산도를 중화하기 위해 1N NaOH의 20μl를 추가합니다. Sol'n는 노란색에서 핑크색 즉시 명확로 이동합니다. 또한, 트랜스페린의 추가 후, 즉시 산도를 중화하고 precipitates의 형성을 방지하기 위해, 1N NaOH의 20μl 추가할 수 있습니다.
- 5 aliquots (일괄)에 serological pipet과 분열로 10ml를 그립니다.
- 스토어 @ -20 ° C.
- 한 번에 두 배치를 할 수 있습니다.
해리 미디어
A. Papain (1 정도지)
** 바로 해부하기 전에 도금의 하루를 준비합니다.
| 성분 | 금액 </ strong>을 | (주) 파이널 콩크. |
| 시스테인 워터 | 7.8mL | 1mM의 시스테인 |
| Papain | 병에 대해 (* 190μl를 다름 44.0mg/ml) | 20 단위 / ML (400 단위 합계 sol'n의 가치에 대한 20ml) |
| H & B CONC. | 2mL | |
| Carbogen | 95% O2 + 5% CO2 | |
| HCL 5N | 10μl | |
| 0.5 % 페놀 레드 | 20μl | 0.001 % |
| 0.5M Kynurenate | 10μl | (1N NaOH에서) 0.5mM |
- 먼저 시스테인 물에 papain을 추가합니다.
- H & B CONC., kynurenate, HCL, 그리고 페놀 빨간색을 추가합니다.
- 분리의 약병에 필터 (로 설정 방향에서 설명)와 carbogen에 연결합니다.
B. H & B는 컨센트레이트 (배의 100ml) :
| 재료 | MW | Powder/50ml H 2 O | 콩크. (M) | 컴바인 (ML) | 최종 콩크. (㎜) |
| NaCl | 58.44 | 11.699 g | 4 | 14.5 | 116 |
| KCl | 74.56 | 3.728 g | 1 | 2.7 | 5.4 |
| NaHCO 3 | 84.01 | 4.2 g | 1 | 13 | 26 |
| 아니 2 PO 4 * H 2 O | 137.99 | 6.90 g | 1 | 1 | 2 |
| MgSO 4 | 120.38 | 6.019 g | 1 | 0.5 | 1 |
| EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) (ED2 - SS) | 292 | 시그마 5 % (확인 5g/100ml 주식) | 0.134 | 0.3722 | 0.5 |
| 포도당 | 180 | 시그마 45% | 2.5 | 5 | 25 |
| TC H 2 O | 62.93 |
- 재고 솔루션에서 금액을 결합합니다.
- 4ml aliquots로 나눕니다.
- papain를 추가한 후 시스테인 물을 나누어지는를 추가합니다.
C.의 시스테인 워터 (1X의 157.5ml)
| 재료 | MW | 구성 요소 파우더 (MG) | H 2 O (ML) | 증권 콩크. (㎜) | 컴바인 (ML) | 최종 콩크. (㎜) |
| CaCl 2 | 147.2 | 736 | 10 | 500 | 0.6 | 1.9mM |
| 시스테인 | 121.7 | (1.5) | 24 | 20mM (0.02M) | 10 | 1.27mM (0.88) |
| TC 물 | 146.9 |
- 만들어 4 0.5M CaCl2의 재고 sol'n을 유지 ° C
- 시스테인의 한 사용 sol'n를 만들어 다른 재료와 결합
- 4 15.75 ML과 저장 10 aliquots로 나눌 ° C
GDNF 준비
- 나누어지는의 준비 :
- 무균 탈이온수의 2.4mL와 5μg GDNF의 살균, 동결 건조된 펠렛을 디졸브. 이 GDNF sol'n = 2.08μg/mL의 농도.
- 무균 cryovials에 76.9μl aliquots에 2.08μg/mL GDNF sol'n를 배포합니다. 유리병 당이 = 160ng.
- -20 ° C.에 저장
- 문화뿐만 아니라 :
- 모든 8 요리 1 나누어지는를 녹여.
- 723.1μl의 연결 미디어 / 나누어지는을 추가하여 나누어지는을 희석. 이것은 160ng/800μl GDNF의 sol'n 만들 것입니다.
- ML 당 10ng GDNF의 최종 농도에 대한 각각의 접시에 매체의 2mL이 sol'n의 100μl를 추가합니다.
FDU 준비
FDU - sol'n 1000X 재고 :
| 성분 | 양 | (주) 파이널 콩크. |
| 유리딘 | 247 MG | 16.5 MG / ML |
| 5 FDU (5 fluorodeoxyuridine) | 100 MG (병) | 6.7 MG / ML |
| TC 워터 | 15 ML |
- 16.5 MG / ML 유리딘 15 ML 약간 이상합니다.
- 6.7 MG / ML sol'n FDU를 만들기 위해 FDU 100 MG 병 15 ML 유리딘 sol'n를 추가합니다.
- -20 ° C.에 200μl aliquots 및 동결로 나누다
이용 희석 :
- 비의 연결을 세포의 성장을 억제. 1.8 ML의 멤에 200μl 주식을 추가하여 1000X 재고 1시 10분을 희석.
- 각 요리의 바깥 고리에 20μl 희석 FDU을 추가합니다. 자주 pipet 도움말을 변경합니다. 커버 및 인큐베이터로 돌아갑니다.
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Discussion
방법은 조직이나 생체내 접근 달리 사용할 수없는 중앙 도파민의 뉴런의 형태학의 및 neurochemical 기능 좋은 해상도를 허용 여기에서 설명한.
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Acknowledgments
작품은 DK065872 (ENP), 바이오 메디컬 연구에 우수의 스미스 가족 재단 수상 (ENP), F31 DA023760 (BMG, ENP)과 P30 NS047243 (신경 과학 연구 플로팅 센터)에서 지원했다.
Materials
| Materials are included in the protocol text. |
References
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
- Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
- Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).
