Summary
Первичная диссоциированных культурах допамина мозга ячейки позволяют изучение характеристик пресинаптических дофаминовых нейронов. Они могут быть использованы для мониторинга в режиме реального времени высвобождение дофамина кинетики и белка / мРНК регуляторов допамина экзоцитоза. Здесь мы покажем вам, как создать эти культуры от грызунов новорожденных.
Abstract
Возможность создания первичных клеточных культур дофаминовых нейронов позволяет для изучения характеристик пресинаптических дофаминовых нейронов в отрыве от системного участии в других местах в головном мозге. В нашей лаборатории мы используем эти нейроны оценить допамина кинетики релиз использованием углеродного волокна amperometry, а также выражение уровень допамина связанных генов и белков с использованием количественных ПЦР и иммуноцитохимия. В этом видеоролике мы покажем, как мы генерируем эти культуры от грызунов новорожденных.
Процесс включает несколько этапов, в том числе покрытие корковых глиальные астроциты, кондиционирования нейронов СМИ культуре клеток глии подложки, рассечение мозга у новорожденных, пищеварение, экстракции и покрытие дофаминовых нейронов и того нейротрофических факторов обеспечить выживаемость клеток.
Применениям для таких подготовки включают электрофизиологии, иммуноцитохимия, количественный ПЦР-, видео-микроскопии (т. е. в режиме реального времени везикулярного слияния с плазматической мембраной), анализы жизнеспособность клеток и других токсикологических экранов.
Protocol
Подготовка Предшествующие культуры
Примечание: ** глиальные клетки должны быть покрыты заблаговременно, с тем, что у них есть время, чтобы размножаться и покрывает дно посуды. Для мышей с атипичными или экспериментальные генетический фон, убедитесь, что в соответствии глиальных и нейрональных культурах с точки зрения генотипа.
Примечание: ** 1-7 дней до вскрытия, подготовки свежих нейронов среднего и заменить глиальных среды в блюда с 2 мл.
Примечание: ** За день до вскрытия, следующие элементы должны быть оставлены в УФ-свете с ночлегом:
- 4 пластины рассечение
- 2 диссоциации флаконах с микро-магнитной мешалкой
- 2 флакона колпачков (с 2-мя маленькими отверстиями ткнул в верхней части)
- Разложите слайд кольца (и пальто в 70% этанола) - оставить окно открытым и
- По крайней мере 2 полными коробками желтых (10-200 мкл) наконечники
- 1 коробка синего (100-1000μl) наконечники
День культуры
Примечание: * Убедитесь, что не трогайте ничего, что осталось OUT для УФ ночным!
Поддержание стерильных условиях под капотом очень важно.
1) Настройка:
Примечание: ** Отложите все замороженные компоненты, чтобы сделать папаин решение.
- Чистая щипцы с 70% этанола. Обложка каждого наконечник с желтым кончиком стерильной пипеткой. Используйте для стерильных место кольца слайд в своей коробке.
- Горячая пластина:
- Место mini-magnetic/hot пластины под капот с 1000 мл стакан заполнен до 500-600мл дН 2 O и большой магнитной мешалкой.
- Место диск пенополистирола в стакане чуть выше уровня воды.
- Слайд термометра в маленькое отверстие в диске пенополистирола. Тепло набора должна быть чуть выше 2 (для темп 34 ° С) и перемешать набора должна быть ~ 5-6.
- PBS:
- Подготовка стерильной PBS и заполнить 15 стерильные 15 мл пробирки с 4-6 мл (не забудьте сохранить стерильный
техники). - Место труб и акции бутылки на лед рядом с капюшоном.
- Подготовка стерильной PBS и заполнить 15 стерильные 15 мл пробирки с 4-6 мл (не забудьте сохранить стерильный
- Карбогена:
- Перерыв 5 мл stripette пополам и нажмите на нее через резиновую пробку, так что кончик stripette торчит широкий конец пробки.
- Место пробку в 500 мл колбу с 400-500мл дН 2 O (сломанный конец stripette должно быть в дН 2 O).
- Подключите трубку на боковое отверстие колбы.
- Отрежьте кончик желтый наконечник пипетки и подключить его к концу трубки (с разрезанной стороной наружу).
Подключите карбогена бак до кончика 5 мл stripette.
- Подготовка папаин sol'n:
- * Используйте осторожно стерильной техники.
- Смешайте в стерильные 50 мл трубки.
- Фильтры папаин sol'n во флакон диссоциации:
- Используйте блок Steriflip фильтрации и передачи флакон 25мл диссоциации через stripette (или местом, новым 0,2 мкм фильтр шприца на кончике шприца 20мл,
удалить поршень и использовать stripette (25 мл), чтобы передать все sol'n папаин в шприц. - Фильтр в пробирку диссоциации).
- Крышка флакона, вставить стерильного шприца через отверстие в крышке и приложить стерильную 0,2 мкм фильтр шприца до основания шприца.
- Подключите карбогена к фильтру и парафильмом этом на месте. Место флаконе в пенополистирола диск / держатель.
* Микро-магнитной мешалкой должно быть в движении.
* Газ должен делать его в пробирку.
* Температура должна стабилизироваться на уровне 34 ° C.
- Используйте блок Steriflip фильтрации и передачи флакон 25мл диссоциации через stripette (или местом, новым 0,2 мкм фильтр шприца на кончике шприца 20мл,
- Препарирование приготовительные:
- Принесите рассечение микроскоп под капотом.
- Разложите все рассечение инструментов на алюминиевую фольгу, спрей с 70% этанола, слейте избыток и оставить под капотом высохнуть.
- Подготовка нейронной среды:
- Оставьте 30 мл свежего нейронной среды в инкубаторе.
- Выложить один большой квадрат из алюминиевой фольги и 12 маленьких квадратов. Оставьте обезглавливание ножницы с алюминиевой фольгой. Заполните небольшую коробку пенополистирола с ледяной водой и оставьте все за пределами капотом.
- Подготовка анестезии (кетамин и 0.075ml 0.075ml xzylazine).
- Получите по крайней мере 12 щенков (P0-P2) на 100 пластин. Для мышей, убедитесь, что генотип матче за весь помет. Если генотип неизвестно, плиты клетки от каждого щенка на отдельном блюде, вести точный учет мыши цифры и сопоставить их с блюдами культуре клеток и убедитесь, что генетический фон глиальных субстрат равномерно через клеточные культуры.
2) Препарирование
- Обезболить первое животное с внутрибрюшинного введения. Когда животное проявляет седативного эффекта и не реагирует на хвост Флик испытаний; положил его во льду в течение 30 секунд (пока гипотермия). Промыть одной маленькой алюминиевой фольги квадрат, decapтации ножницы, и голову с 70% этанола.
- Обезглавьте, позволяют голову падают на алюминиевой фольги квадрат и двигаться под капотом. Аккуратно снимите мозг в 15 мл трубки ледяной PBS. Место трубку обратно на лед при удалении следующего мозга.
- Повторите эти первые шаги, пока Есть 3 мозги на льду. Залить все 3 мозги и PBS, на первое блюдо рассечение под микроскопом. Удалите соответствующий раздел мозга (VTA) и использовать передачу пипетки поставить сегментов в папаин sol'n. Начало таймер, когда первые сегменты войти
- Повторите предыдущие три действия, пока все мозги переваривается в папаин. Среднее время для переваривания пищи должен быть 2 часа. Первые сегменты были в течение приблизительно 1 часа к тому времени, последние из них войти
Попробуйте разделить разницу. - * Во время пищеварения:
- Убедитесь, что температура в ванне 34 ° C.
- Сегменты могут прилипнуть к мешалкой сначала, но должно было распространено, как время идет. Если они не будут, нажмите дне флакона.
3) Растирание:
- Использование передачи пипетки, передача мозга сегменты стерильные 15 мл трубки (старайтесь избегать избыточного папаин sol'n) и промыть их 3 раза с 2 мл подогретой глиальных среды из инкубатора. После сдачи глиальных СМИ в трубке, позволяющие сегментов отстояться и затем осторожно удалить как можно больше sol'n возможно, не нарушая сегментов. Изменение пипетки, чтобы избежать загрязнения!
** НЕ ДЕРЖИТЕ sol'n, что удаляется. - Использование свежей пипетки передачи начинаются triturations в 2 мл глиальных СМИ. Растирают в 25 раз (избегайте впуская пузырьки воздуха), и пусть сидят трубку в течение 3 минут, пока недиссоциированных сегментов обосноваться. Использование передачи пипетки удалить, и держать столько sol'n возможно, не нарушая сегменты в нижней части. Держите супернатант в новой (стерильные) 15 м трубы.
- Повторите предыдущий шаг, используя 1000μl пипетки и 200 мкл пипетки до полного диссоциирован.
- Растирают в 10 раз с передачи пипетки, или пока клетки полностью ресуспендировали в sol'n.
4) Клетки Покрытие
- Использование стерильных желтый наконечник пипетки по каждой кончик пинцетом, осторожно удалить слайд кольцо, как в центре, чтобы стекла, а также возможные в каждом блюде.
- Поместите 10 мкл ячейки решение на hemacytometer и считать. (Исключить нежелательной массы).
- Умножьте количество клеток на 10. Это число клеток / мкл. Разделите 1,000,000-1,500,000 (или желаемой плотности) на это число. Это число мкл, чтобы добавить в блюдо.
- Использование пипетки скользить кольца, над центральной и каждого блюда по мере добавления соответствующих мкл / блюдо. Пластина их мягко и переключиться советов для каждого блюда.
- Добавить 100 мкл (из разбавленных) GDNF sol'n внутри слайд кольцо каждого блюда.
- В это время, место лотков в инкубаторе и принести нейронной среды в холодном помещении.
- Разрешить клетки решить в одночасье.
- Следующий день: снимите кольца (с использованием новых стерильные наконечники пипеток покрытие щипцов советов для каждого блюда)
5) Митотическая Ингибирование: СЛЕДУЮЩИЙ ДЕНЬ
- Развести FDU аликвоты 1000X 1:10 акции путем добавления 200 мкл фондовом FDU до 1,8 мл стерильного MEM.
- Добавить 20 мкл разбавленного FDU sol'n к внешнему кольцу каждого блюда. Изменение наконечники часто. Накрыть крышкой и вернуться в инкубаторе.
* Беспокоить блюда как можно меньше в течение следующих 7-10 дней. Проверьте инфицированных блюд и удалять зараженные блюда при первых признаках инфекции. Культуры готовы для тестирования в течение 3 недель.
МЕДИА / РЕШЕНИЯ
Нейронов среднего
(На 200 мл)
** Лучше всего, если в зависимость от глии из колбы ночь перед использованием для мойки / растиранием
| Ингредиент | Количество | Примечания |
| BSA 5% | 0,5 г | Доля V |
| MEM жидкости | 94,0 мл | Сигма |
| DMEM жидкости | 80,0 мл | Сигма |
| F-12 жидком | 20,0 мл | Сигма |
| Глюкоза 45% жидкости | 1,50 мл | Sigma решение |
| Глутамин 200 мМ | 0,5 мл | Aliquotted решение Sigma |
| Diporzio Конц. | 2,0 мл | Sigma решение |
| Жидкие Каталаза | 0,1 мл | |
| Кинуреновой кислоты 0,5 М | 200 мкл | В 1N NaOH |
| HCL 5N | 50 мкл |
- Комбинат ингредиенты (BSA идет последним) в 250 мл пластиковые бутылки.
- Фильтр, этикетки, и поставить в холодильник.
Кинуреновой кислота
(FW = 189,2)
0,5 М = 94.6mg/ml
Сделать 8ml складе: 756.8mgKA/8ml 1N NaOH и пипеткой в стерильную аликвоты 200 мкл
DiPorzio СМИ
) DiPorzio Конц. Акции:
| НУЖНА | Объединять | Alliquot | ||||||
| Добавка | Растворитель | Трубка | Количество | мл | мл / трубки | Конц. | Количество | # Алик. |
| Инсулин | 20 мМ HCL (1) | пластик | 250 мг флакон | 10 | 1 | 25mg/ml | 25 мг | 10 |
| Трансферрина | Хэнка | 500 мг флакон | 5 | 1 | 100мг/мл | 100 мг | 5 | |
| SOD | Хэнка | 70мг флакон | 14 | 1 | 5mg/ml | 5 мг | 14 | |
| Путресцин | Хэнка | 50 мг | 3 | 0,12 | 20mg/ml | 2.4mg | 21 | |
| Na 2 SeO 3 | Хэнка | 0.104mg | 10 | 0,5 | 10μg/ml | 5.2μg | 20 | |
| T3 | 10 мМ NaOH | 2мг | 10 | 0,1 | 0.20mg/ml | 0 мг | 100 | |
| Прогестерон | 100% этанола | Стекло | 12,5 мг | 10 | 0,05 | 1.25mg/ml | Используйте пипетку | |
| Кортизол | 100% этанола | Стекло | 20мг | 10 | 0,02 | 2.00mg / мл | Используйте пипетку | |
- 20 мМ HCl = 41.5μl конц. HCl/25ml.
- Сделать 1mg/ml акции и добавить 104μl на 10 мл.
Б) DiPorzio СМИ складе:
| Добавка | Сумма (мл) | Сумма (мл) X2 | Заключительные Конц. мкг / мл | Заключительные Конц. Молярность |
| Прогестерон | 0,05 | 0,1 | 0,06 | 200 нм |
| Кортизол | 0,02 | 0,04 | 0,04 | 125nM |
| Хэнка BSS | 6,21 | 12,42 | ||
| Инсулин | 1 | 2 | 25 | |
| Na 2 SeO 3 | 0,5 | 1 | 0,01 | 30нм |
| T3 | 0,1 | 0,2 | 0,02 | 30нм |
| SOD | 1 | 2 | 5 | |
| Путресцин | 0,12 | 0,24 | 2,4 | 15nM |
| Трансферрина | 1 | 2 | 100 |
- Используйте 15 мл polyproylene стерильную пробирку добавить прогестерона и кортизола. Используйте пипетку и вакуумного аспиратора для ускорения испарения этанола: (используйте 5 мл stripette сломанный пополам и положите на полпути вниз в трубу быть очень осторожными, чтобы не аспирата EtOH жидкости Держите пипетку надежно фиксироваться Kimwipes а затем принести чаевые. до 500 мкл марка находится на стороне трубки.
- Добавить последующие аликвоты в порядке их появления на графике выше.
- После того инсулина, что делает облачно раствор, добавить 20 мкл 1 н NaOH для нейтрализации рН. Sol'n должно идти от желтого до розового и сразу ясно. Кроме того, после того трансферрина, сразу же добавить 20 мкл 1 н NaOH, чтобы нейтрализовать рН и предотвратить образование осадков.
- Составить 10 мл в серологические пипетки и разделить на 5 порций (одна порция).
- Магазин при -20 ° C.
- Сделать 2 мая партий сразу.
Диссоциация СМИ
А. Папаин (за 1 флакон):
** Подготовка день покрытие прямо перед рассечение.
| Ингредиент | Сумма </ STRONG> | (Заметки) Заключительный Конц. |
| Цистеин воды | 7.8mL | 1mM цистеина |
| Папаин | Варьируется (* 190μl за бутылку 44.0mg/ml) | 20 ед / мл (400 единиц общего за 20 мл сумму sol'n) |
| H & B конц. | 2 мл | |
| Карбогена | 95% О2 + 5% CO2 | |
| HCl 5N | 10 мкл | |
| 0,5% Фенол красный | 20 мкл | 0,001% |
| Kynurenate 0.5M | 10 мкл | (В 1N NaOH) 0,5 мм |
- Добавить папаин, чтобы цистеина воду.
- Добавить H & B конц., Kynurenate, HCl, и фенол красный.
- Фильтры в флаконе диссоциации (как описано в настройке направления) и подключиться к карбогена.
B. H & B концентрата (100 мл 5 раз):
| Ингредиенты | МВт | Powder/50ml H 2 O | Конц. (М) | Комбинат (мл) | Заключительные Конц. (ММ) |
| NaCl | 58,44 | 11,699 г | 4 | 14,5 | 116 |
| KCl | 74,56 | 3,728 г | 1 | 2,7 | 5,4 |
| NaHCO 3 | 84,01 | 4,2 г | 1 | 13 | 26 |
| NaH 2 PO 4 * H 2 O | 137,99 | 6,90 г | 1 | 1 | 2 |
| MgSO 4 | 120,38 | 6,019 г | 1 | 0,5 | 1 |
| ЭДТА (ED2-SS) | 292 | Sigma 5% (сделать 5g/100ml акций) | 0,134 | 0,3722 | 0,5 |
| Глюкоза | 180 | Sigma 45% | 2,5 | 5 | 25 |
| TC H 2 O | 62,93 |
- Комбинат сумм со склада решений.
- Разделить на 4 мл аликвоты.
- Добавить аликвоту в цистеин водой после добавления папаин.
С. Цистеин Вода (157.5ml из 1X):
| Ингредиенты | МВт | Компоненты Порошок (мг) | H 2 O (мл) | Сток Конц. (ММ) | Комбинат (мл) | Заключительные Конц. (ММ) |
| CaCl 2 | 147,2 | 736 | 10 | 500 | 0,6 | 1,9 мм |
| Цистеин | 121,7 | (1.5) | 24 | 20 мм (0,02 М) | 10 | 1,27 мм (0.88) |
| TC воды | 146,9 |
- Обеспечения и поддержания фондовых sol'n 0,5 М CaCl2 при 4 ° С
- Сделайте одно использование sol'n цистеина и в сочетании с другими ингредиентами
- Разделите на 10 аликвоты 15,75 мл и хранят при температуре 4 ° C
Подготовка GDNF
- Алиготе приготовительная:
- Растворите стерильный, лиофилизированный гранул 5 мкг GDNF с 2.4mL стерильной деионизированной водой. Концентрация этого GDNF sol'n = 2.08μg/mL.
- Распространение 2.08μg/mL GDNF sol'n в 76.9μl аликвоты в стерильные криопробирки. Это = 160ng одном флаконе.
- Хранить при -20 ° C.
- Дополнение к культурам:
- Оттепель 1 аликвоту на каждые 8 блюд.
- Развести аликвоту, добавив 723.1μl нейронов СМИ / аликвоту. Это сделает sol'n из 160ng/800μl GDNF.
- Добавить 100 мкл этого sol'n в 2 мл среды в каждое блюдо для конечной концентрации 10ng GDNF на мл.
Подготовка FDU
FDU-sol'n 1000X складе:
| Ингредиент | Количество | (Заметки) Заключительный Конц. |
| Уридина | 247 мг | 16,5 мг / мл |
| 5-FDU (5-fluorodeoxyuridine) | 100 мг (флакон) | 6,7 мг / мл |
| TC воды | 15 мл |
- Сделать чуть более 15 мл 16,5 мг / мл уридина.
- Добавьте 15 мл уридина sol'n до 100 мг бутылка FDU сделать 6,7 мг / мл sol'n FDU.
- Разделить на 200 мкл аликвоты и заморозить в -20 ° C.
Развести по применению:
- Подавляют рост не-нервных клеток. Развести 1000X 1:10 акции путем добавления 200 мкл акции до 1,8 мл MEM.
- Добавить 20 мкл разбавленного FDU к внешнему кольцу каждого блюда. Изменение пипетки советы часто. Накрыть крышкой и вернуться в инкубаторе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Методы, описанные здесь, позволяют высоким разрешением морфологических и нейрохимических функций центральных нейронов допамина, которые иначе недоступны в системном или в естественных условиях подход.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке DK065872 (ЕПС), Фонд Смит Семья премии передовых технологий в области биомедицинских исследований (ЕПС), F31 DA023760 (BMG, ЕПС) и P30 NS047243 (Тафтса центр в области нейронаук).
Materials
| Materials are included in the protocol text. |
References
- Geiger, B. M., Behr, G. G., Frank, L., Caldera-Siu, A. D., Beinfeld, M. C., Kokkotou, E. G., Pothos, E. N. Evidence for defective mesolimbic dopamine exocytosis in obesity-prone rats. FASEB Journal. 8, 2740-2746 (2008).
- Pothos, E. N. Regulation of dopamine quantal size in midbrain and hippocampal neurons. Behavioural Brain Research. 130, 203-207 (2002).
- Pothos, E. N., Larsen, K. E., Setlik, W., Gershon, M. D., Krantz, D., Liu, Y. -J., Edwards, R. H., Sulzer, D. Synaptic vesicle transporter expression regulates vesicle phenotype and quantal size. The Journal of Neuroscience. 20, 7297-7306 (2000).
- Pothos, E. N., Davila, V., Sulzer, D. Presynaptic recording of quanta from midbrain dopamine neurons and modulation of the quantal size. The Journal of Neuroscience. 18, 4106-4118 (1998).
- Sulzer, D., Pothos, E. N. Presynaptic mechanisms that regulate quantal size. Reviews in the Neurosciences. 11, 159-212 (2000).
