Primär dissocierade mitthjärnan Dopamin cellkulturer från Gnagare Nyfödda

Summary

Primär dissocierade mitthjärnan dopamin cellkulturer möjliggöra studier av presynaptiska egenskaper dopaminneuron. De kan användas för att övervaka i realtid kinetik dopaminfrisättning och protein / mRNA nivåer av regulatorer av dopamin exocytos. Här visar vi hur du skapar dessa kulturer från gnagare nyfödda.

Abstract

Möjligheten att skapa primära cellkulturer av dopaminneuron möjliggör studier av presynaptiska egenskaper dopaminneuron isolerat från systemisk input från andra håll i hjärnan. I vårt labb använder vi dessa nervceller att bedöma dopaminfrisättning kinetik med amperometry kolfiber, liksom nivåerna uttryck av dopamin relaterade gener och proteiner med hjälp av kvantitativ PCR och immuncytokemi. I denna video visar vi hur vi skapar dessa kulturer från gnagare nyfödda.

I processen ingår flera steg, bland annat plätering av kortikal gliaceller astrocyter, konditionering av neuronala medier cellkulturer av gliaceller substratet, dissektion av mellanhjärnan hos nyfödda, matsmältningen, utvinning och plätering av dopamin neuroner och tillägg av neurotrofa faktorer se cellöverlevnad.

Det program lämpade för en sådan beredning inkluderar elektrofysiologi, immuncytokemi, kvantitativ PCR, video mikroskopi (dvs i realtid SVD fusion med plasmamembranet), cell-analyser livskraft och andra toxikologiska skärmar.

Protocol

Förberedelser före Kultur

Obs: ** Gliaceller måste klädd i god tid så att de har tid att föröka sig och täcka botten av rätter. För möss med atypiska eller experimentella genetisk bakgrund, se till att matcha gliaceller och nervceller kulturer i termer av genotyp.

Obs: ** 1-7 dagar före dissekering, bered nya neuronala medium och ersätta gliaceller mediet i rätter med 2ml.

Obs: ** På dagen före dissekering följande produkter måste lämnas under UV-ljus över natten:

• 4 dissektion plattor
• 2 dissociation injektionsflaskor med en mikro-magnetisk omrörare
• 2 flaska kapsyler (med 2 små hål petade i topp)
• Sprid ut slide ringar (och kappa i 70% EtOH) - lämna rutan öppen även
• MINST 2 hela kartonger med gul (10-200μl) pipettspetsar
• 1 låda med blå (100-1000μl) pipettspetsar

Dag för kultur

Anmärkning: * Se till att inte röra något som fanns kvar UT FÖR UV över en natt!

Att upprätthålla en steril miljö under huven är mycket viktigt.

1) Ställ upp:

Obs: ** Avsätt alla frysta ingredienser för att göra papain lösning.

1. Rengör pincett med 70% EtOH. Täck varje spets med en steril gul pipettspetsen. Används för att placera sterila glida ringar i sin låda.
2. Värmeplatta:
   1. Placera en mini-magnetic/hot plattan under huven med en 1000ml bägare fylld till 500-600ml dH ₂ O och en stor magnetisk omrörare.
   2. Placera en frigolit skiva i bägaren precis ovanför vattenytan.
   3. Skjut termometern i ett litet hål i frigolit disken. Värme ratten behöver något över 2 (för en temp på 34 ° C) och rör om ratten borde ~ 5-6.
3. PBS:
   1. Förbered sterila PBS och fyller 15 sterila 15 ml rör med 4-6 ml (se till att behålla steril
      teknik).
   2. Placera rören och beståndet flaskan på is intill huven.
4. Carbogen:
   1. Bryt en 5ml stripette på mitten och pressa den genom en gummipropp, så spetsen på stripette sticker ut den breda änden av proppen.
   2. Placera proppen i en 500 ml kolv med 400-500ml dH ₂ O (bruten slutet av stripette bör vara i dH ₂ O).
   3. Anslut ett rör på sidan öppnandet av kolven.
   4. Skär av spetsen en gul pipettspets och anslut den till slutet av röret (med den skurna sidan vänd utåt).
      
      Anslut carbogen tanken till toppen av 5ml stripette.
      
      
5. Förbered papain sol'n:
   1. * Använd försiktig steril teknik.
   2. Blanda i ett sterilt 50 ml rör.
6. Filtrera papain sol'n i dissociation flaskan:
   1. Använd en enhet Steriflip filtrering och överföring till dissociation flaskan via 25ml stripette (eller den plats ett nytt 0.2μm spruta filter på toppen av en 20ml kolv spruta,
      Ta ut kolven och använda en stripette (25 ml) att överlåta samtliga papain sol'n i sprutan.
   2. Filtret i dissociation flaskan).
   3. Cap flaskan, sätt in en steril spruta genom hålet i locket och bifoga en steril 0.2μm sprutfilter till basen på sprutan.
   4. Anslut carbogen till filtret och parafilm detta på plats. Placera injektionsflaskan i frigolit skiva / innehavaren.
      
      * Den mikro-magnetisk omrörare måste flytta.
      * Gasen skall vara att göra den i flaskan.
      * Temperaturen måste stabiliseras vid 34 ° C.
      
      
7. Dissection prep:
   1. Ta med dissektion mikroskop under huven.
   2. Lägg ut alla dissektion instrument på aluminiumfolie, spraya med 70% EtOH, häll av överflödigt och lämna under huven för att torka.
8. Förbered neuronala medium:
   1. Lämna 30ml av färska neuronala mediet i inkubatorn.
9. Lägg ut en stor fyrkant av aluminiumfolie och 12 mindre rutor. Lämna halshuggning sax med aluminiumfolie. Fyll en liten frigolitlåda med is vatten och låt hela utsidan av rampen.
10. Prep anestesi (0.075ml ketamin och 0.075ml xzylazine).
11. Få minst 12 valpar (P0-P2) för 100 tallrikar. För möss, se till att det finns en genotyp match för hela kullen. Om genotyp är okänd, platta celler från varje valp på en separat skål, föra noggranna register över mus nummer och matcha dem med rätter cellodling och se till att den genetiska bakgrunden till gliaceller underlaget är enhetligt i cellkulturer.

2) Dissection

1. Bedöva det första djuret med en intraperitoneal injektion. När djuret visar sedering och svarar inte på tail-flick test, lägga den i isen i 30 sekunder (tills hypotermi). Skölj ett litet torg aluminiumfolie, Decapitation sax och huvud med 70% EtOH.
2. Halshugga, låt huvudet falla på aluminiumfolie torget och flytta under huven. Ta försiktigt bort hjärnan till en 15ml tub iskall PBS. Placera röret tillbaka på isen och ta av nästa hjärnan.
3. Upprepa de första stegen tills det är 3 hjärnor på is. Häll alla 3 hjärnor och PBS på den första dissektion skålen under mikroskop. Ta lämpligt avsnitt av hjärnan (VTA) och göra en överföring pipett att sätta segmenten i papain sol'n. Starta en timer när de första segmenten gå in
4. Upprepa föregående tre steg tills alla hjärnor är under rötas i papain. Den genomsnittliga tiden för matsmältningen ska vara 2 timmar. De första segmenten kommer att ha i ca 1 timme med den tid de sista gå in
   
   Försök att dela skillnaden.
   
   
5. * Under matsmältning:
   1. Se till att temp i badet är 34 ° C.
   2. Segment kan hålla sig till de omrörare i början, men bör spridas ut med tiden. Om de inte gör, peka på botten av flaskan.

3) Trituration:

1. Med hjälp av en pipett hjärnan segmenten till en steril 15 ml rör (försök att undvika överskott papain sol'n) och tvätta dem 3 gånger med 2 ml värmde gliaceller medium från inkubatorn. Efter att sätta gliaceller medierna i röret, låt segment för att bosätta sig och sedan försiktigt bort så mycket sol'n som möjligt utan att störa segment. Byt pipetter för att undvika kontaminering!
   
   ** Förvara inte de sol'n som tas bort.
   
   
2. Med hjälp av en ny överföringspipett börja trituration i 2 ml av stödjeceller medier. Mal sönder 25 gånger (undvika att släppa in luftbubblor) och låt röret sitta i 3 minuter tills odissocierad segment lösa. Använd en överföringspipett att ta bort och behålla så mycket sol'n som möjligt utan att störa segment längst ner. Förvara supernatanten i en ny (steril) 15m rör.
3. Upprepa föregående steg med hjälp av en 1000μl pipett och 200μl pipett tills helt dissocierade.
4. Mal sönder 10 gånger med en överföringspipett, eller tills cellerna är helt återsuspenderade i sol'n.

4) Plating celler

1. Använd en steril gul pipettspets täcker varje toppen av pincett, försiktigt släppa en bild ring som centrerad till glaset så bra som möjligt inom varje maträtt.
2. Sätt 10μl av cellen lösningen på hemacytometer och räkna. (Exkludera skräp massorna).
3. Multiplicera antalet celler med 10. Detta är antalet celler / mikroliter. Dela 1,000,000-1,500,000 (eller önskad densitet) med detta nummer. Detta är antalet l att lägga per maträtt.
4. Använd pipettspetsen att glida ringar över centrum brunnar av varje maträtt som du lägger till lämplig l / maträtt. Plate dem försiktigt och byta tips för varje maträtt.
5. Tillsätt 100μl (efter utspädning) GDNF sol'n inuti bilden ring av varje rätt.
6. Vid denna tid, plats facken i inkubatorn och föra neuronala mediet i kylrum.
7. Låt celler till sig under natten.
8. Nästa dag: ta bort ringarna (med hjälp av ny steril pipettspetsar täcker pincett tips för varje maträtt)
   

5) mitotiskt Hämning: nästa dag

1. Späd FDU alikvoter av 1000X lager 1:10 genom att lägga 200μl FDU lager till 1,8 ml steril MEM.
2. Lägg 20μl utspädd FDU sol'n på utsidan ringen av varje rätt. Byt pipettspetsar ofta. Täck över och återgå till inkubatorn.
   
   * Stör disken så lite som möjligt för de kommande 7-10 dagar. Kontrollera om det smittade rätter och ta bort alla infekterade rätter vid första tecken på infektion. Kulturer är redo för testning inom 3 veckor.

Media / lösningar

Neuronal Medium

(För 200ml)

** Bästa om förutsättning av Glia från flaskor natten innan användning för tvättar / trituration

Ingrediens	Belopp	Anteckningar
BSA 5%	0,5 g	Bråk V
MEM flytande	94,0 ml	Sigma
DMEM flytande	80,0 ml	Sigma
F-12 flytande	20,0 ml	Sigma
Glukos 45% flytande	1,50 ml	Sigma lösning
Glutamin 200mm	0,5 ml	Aliquotted Sigma lösning
Diporzio Konc.	2,0 ml	Sigma lösning
Flytande Catalase	0,1 ml
Kynurensyra 0,5 M	200μl	I 1N NaOH
HCL 5N	50 l

1. Kombinera ingredienser (BSA går sista) i en 250ml plastflaska.
2. Filter, märkning och kyla.

Kynurensyra
(FW = 189,2)
0,5 M = 94.6mg/ml
Gör 8ml lager: 756.8mgKA/8ml 1N NaOH och pipett till sterila alikvoter av 200μl

DiPorzio Media

A) DiPorzio Konc. Aktier:

BEHOV			Kombinera			Alliquot
Tillsats	Lösningsmedel	Tube	Belopp	ml	ml / rör	Konc.	Belopp	# Aliq.
Insulin	20mm HCL (1)	plast	250mg flaska	10	1	25mg/ml	25mg	10
Transferrin	Hanks		500mg flaska	5	1	100mg/ml	100mg	5
TORVTÄCKA	Hanks		70 mg flaska	14	1	5mg/ml	5 mg	14
Putrescine	Hanks		50 mg	3	0,12	20mg/ml	2.4mg	21
Na 2 Seo 3	Hanks		0.104mg	10	0,5	10μg/ml	5.2μg	20
T3	10 mM NaOH		2mg	10	0,1	0.20mg/ml	0mg	100
Progesteron	100% EtOH	Glas	12,5	10	0,05	1.25mg/ml	Använd pipett
Kortisol	100% EtOH	Glas	20mg	10	0,02	2.00mg / ml	Använd pipett

1. 20mm HCl = 41.5μl konc. HCl/25ml.
2. Gör 1mg/ml lager och lägga 104μl till 10ml.

B) DiPorzio Media Lager:

Tillsats	Belopp (ml)	Mängden (ML) X2	Final Konc. mikrogram / ​​ml	Final Konc. Molaritet
Progesteron	0,05	0,1	0,06	200Nm
Kortisol	0,02	0,04	0,04	125nM
Hank är BSS	6,21	12,42
Insulin	1	2	25
Na 2 Seo 3	0,5	1	0,01	30nm
T3	0,1	0,2	0,02	30nm
TORVTÄCKA	1	2	5
Putrescine	0,12	0,24	2,4	15Nm
Transferrin	1	2	100

1. Använd en 15ml polyproylene sterilt rör för att lägga till progesteron och kortisol. Använd en aspirator pipett och vakuum för att snabba avdunstning av EtOH: (använd en 5ml stripette bruten i två halvor och placera halvvägs ner i röret är mycket noga med att inte aspirera EtOH flytande Håll pipett säkert på plats med Kimwipes och sedan föra spetsen. ner till 500μl märket sitter på sidan av röret.
2. Lägg till den efterföljande delprover i den ordning de visas på tabellen ovan.
3. Efter tillsats av insulin, vilket gör sol'n molnigt, lägga 20μl av 1N NaOH för att neutralisera pH-värdet. Sol'n bör gå från gult till rosa och omedelbart klart. Också, efter tillägg av transferrin omedelbart lägga 20μl av 1N NaOH, för att neutralisera pH och förhindra bildandet av utfällningar.
4. Gör upp 10ml i en serologisk pipett och dela i 5 alikvoter (ett parti).
5. Förvara @ -20 ° C.
6. Kan göra två satser på en gång.

Dissociation Media

A. Papain (för en flaska):

** Förbered dagen plätering precis före dissekering.

Ingrediens	Belopp </ Strong>	(Notes) Slutlig Konc.
Cystein Vatten	7.8mL	1mm cystein
Papain	Varierar (* 190μl för flaska 44.0mg/ml)	20 enheter / ml (400 enheter totalt för 20ml värde av sol'n)
H & B konc.	2ml
Carbogen	95% O2 + 5% CO2
HCl 5N	10μl
0,5% Fenolrött	20μl	0,001%
Kynurenate 0,5 M	10μl	(I 1N NaOH) 0,5 mm

1. Lägg papain till cystein vattnet först.
2. Lägg till H & B konc., Kynurenate, HCl, och fenol rött.
3. Filtrera i dissociation injektionsflaska (som beskrivs i set-up riktningar) och ansluta till carbogen.
   

B. H & B koncentrat (100 ml 5X):

Ingredienser	MW	Powder/50ml H 2 O	Konc. (M)	Kombinera (ml)	Final Konc. (MM)
NaCl	58,44	11,699 g	4	14,5	116
KCl	74,56	3,728 g	1	2,7	5,4
NaHCO 3	84,01	4,2 g	1	13	26
NaH 2 PO 4 * H 2 O	137,99	6,90 g	1	1	2
MgSO 4	120,38	6,019 g	1	0,5	1
EDTA (Ed2-SS)	292	Sigma 5% (se 5g/100ml lump)	0,134	0,3722	0,5
Glukos	180	Sigma 45%	2,5	5	25
TC H 2 O				62,93

1. Kombinera belopp från stamlösningar.
2. Dela upp i 4 ml alikvoter.
3. Lägg alikvot till cystein vatten efter att du lagt papain.
   

C. Cystein Vatten (157.5ml 1X):

Ingredienser	MW	Komponenter Pulver (mg)	H 2 O (ml)	Stock Konc. (Mm)	Kombinera (ml)	Final Konc. (MM)
CaCl 2	147,2	736	10	500	0,6	1.9mm
Cystein	121,7	(1.5)	24	20mm (0.02M)	10	1.27mm (0.88)
TC vatten					146,9

1. Ingå och hålla ett lager sol'n av 0,5 M CaCl2 vid 4 ° C
2. Gör en en användning sol'n av cystein och kombinera med andra ingredienser
3. Dela i 10 alikvoter av 15,75 ml och förvara vid 4 ° C
   

GDNF Förberedelser

1. Alikvotera prep:
   1. Lös steril, frystorkad pellet av 5 mikrogram GDNF med 2,4 ml sterilt avjoniserat vatten. Koncentrationen av denna GDNF sol'n = 2.08μg/mL.
   2. Fördela 2.08μg/mL GDNF sol'n i 76.9μl alikvoter i sterila cryovials. Detta = 160ng per injektionsflaska.
   3. Förvara vid -20 ° C.
2. Tillägg till kulturer:
   1. Tina en delmängd för varje 8 rätter.
   2. Späd alikvot genom att lägga 723.1μl neuronala media / delmängd. Detta kommer att göra en sol'n av 160ng/800μl GDNF.
   3. Tillsätt 100μl denna sol'n till 2 ml av mediet i varje rätt till en slutlig koncentration av 10 ng GDNF per ml.
      

FDU Förberedelser

FDU-sol'n 1000X lager:

Ingrediens	Belopp	(Notes) Slutlig Konc.
Uridin	247 mg	16,5 mg / ml
5-FDU (5-fluorodeoxyuridine)	100 mg (flaska)	6,7 mg / ml
TC Vatten	15 ml

1. Gör lite över 15 ml 16,5 mg / ml uridin.
2. Tillsätt 15 ml uridin sol'n till 100 mg flaska FDU att 6,7 mg / ml sol'n FDU.
3. Dela i 200μl portioner och frysa i -20 ° C.

Späd för användning:

1. Hämma tillväxten av icke-neuronala celler. Späd 1000X lager 1:10 genom att lägga till 200μl lager till 1,8 ml MEM.
2. Lägg 20μl utspädd FDU på utsidan ringen av varje rätt. Byt pipett tips ofta. Täck över och återgå till inkubatorn.

Discussion

De metoder som beskrivs här tillåter fina upplösning på morfologiska och neurokemiska funktioner i centrala dopaminneuron som annars inte finns tillgängliga i en systemisk eller in vivo-metod.

Materials

Materials are included in the protocol text.