Kemirgen Yenidoğanlar İlköğretim grubuyla orta beyin dopamin Hücre Kültürleri

Summary

İlköğretim ayrışmış orta beyin dopamin hücre kültürleri dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için izin verir. Onlar gerçek zamanlı dopamin salınımını kinetik ve dopamin ekzositoz düzenleyicilerin protein / mRNA seviyeleri izlemek için kullanılabilir. Burada, biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin nasıl oluşturmak göstermektedir.

Abstract

Beyin başka sistemik girişi, izolasyon dopamin nöronların presinaptik özellikleri çalışma için, dopamin nöronlar primer hücre kültürleri oluşturma yeteneği sağlar. Bizim laboratuvarda, karbon fiber amperometri, kantitatif PCR ve immünhistokimya kullanarak dopamin ilgili genler ve proteinlerin ekspresyon düzeyleri yanı sıra dopamin salınımını kinetiğini değerlendirmek için bu nöronların kullanın. Biz kemirgen yenidoğanlarda bu kültürlerin üretmek nasıl Bu videoda, size gösteriyor.

Bu süreç kortikal glial astrositler kaplama, klima glial substrat nöronal hücre kültür ortamı, yenidoğanlarda Ortabeyin diseksiyonu, sindirim, ekstraksiyon ve dopamin nöronlarının kaplama ve nörotrofik faktörlerin eklenmesi de dahil olmak üzere birkaç adım içerir hücre sağkalım sağlamak.

Böyle bir hazırlık için uygun uygulamalar elektrofizyoloji, immünhistokimya, kantitatif PCR, video mikroskobu (yani, plazma zarı ile gerçek-zamanlı veziküler füzyon), hücre canlılığı deneyleri ve diğer toksikolojik ekranları içerir.

Protocol

Kültür Önceki Hazırlık

Not: ** Glial hücreler çoğalmalı ve yemekleri alt kapağı var, böylece önceden iyi kaplanmış olmalıdır. , Atipik ya da deneysel genetik bir arka plan ile fareler için, genotip açısından glial ve nöronal kültürlerin maç emin olun.

Not: diseksiyonu ** 1-7 gün önce, taze nöronal orta hazırlamak ve 2ml yemekler glial orta yerine.

Not: ** diseksiyon bir gün önce, aşağıdaki öğeleri gecede UV ışık altında sol gerekir:

• 4 diseksiyonu plakalar
• Bir mikro-manyetik karıştırıcı ile 2 disosiasyon şişeleri
• 2 flakon kapaklar (2 küçük delikler üst dürttü)
• Slayt halkalar (70% EtOH kat) Spread - kutusu da açık bırakın
• EN AZ 2 tam kutu sarı (10-200μl) pipet uçları
• 1 kutu (100-1000μl) mavi pipet uçları

Kültür Günü

Not: * GECELİK UV İÇİN dışında kaldı ANYTHING TOUCH İÇİN EMİN OLUN!

Kaputun altında steril bir ortamda bakımı çok önemlidir.

1) Set Up:

Not: ** papain çözüm olmak için tüm dondurulmuş maddeler kenara koyun.

1. % 70 EtOH Temizlik forseps. Her ucu steril bir sarı pipetlemeyin ucu ile kaplayın. Kendi kutusunda steril slayt yüzük yerleştirmek için kullanın.
2. Sıcak plaka:
   1. 1000ml beher 500-600ml dH ₂ O ve büyük bir manyetik karıştırıcı çubuk dolu bir başlık altında bir mini-magnetic/hot tabak koyun.
   2. Beher, su seviyesinin hemen üzerinde plastik bir disk yerleştirin.
   3. Strafor disk küçük bir delik termometre kaydırın. Isı çevirmeli ihtiyacı biraz 2 'nin üzerinde olması (34 ° C geçici bir) ve heyecan arama ~ 5-6 olmalıdır.
3. PBS:
   1. Hazırlayın ve steril PBS (4-6 ml steril korumak için emin olun 15 15ml steril tüpler doldurmak.
      tekniği).
   2. Kaputun yanında buz üzerinde tüpler ve stok şişe yerleştirin.
4. Carbogen:
   1. Break yarısında 5ml stripette ve bir lastik tıpa ile itin stripette ucu stoper geniş ucunu dışarı taşacak.
   2. 400-500ml dH ₂ O (stripette kırık ucu IN dH ₂ O olmalıdır) 500ml cam şişe içinde stoper yerleştirin.
   3. Balonun yan açılışında bir tüp bağlayın.
   4. Sarı bir pipet ucu kapalı kesin ve tüp sonunda (kesme yüzü dışarı bakacak şekilde) bağlayın.
      
      Carbogen tankı 5ml stripette ucu bağlayın.
      
      
5. Papain sol'n hazırlayın:
   1. * Dikkatli steril teknik kullanın.
   2. 50ml steril bir tüp içinde karıştırın.
6. Filtre ayrışma şişenin içine papain sol'n:
   1. 25ml stripette (OR yer 20ml bir piston şırınga ucu yeni bir 0.2μm şırınga filtresi aracılığıyla Steriflip filtrasyon ünitesi ve disosiasyon flakon transfer kullanın.
      piston kaldırmak ve tüm şırıngaya papain sol'n aktarmak için bir stripette (25ml) kullanabilirsiniz.
   2. Filtre ayrışma şişenin içine).
   3. Flakon kapağı, steril bir şırınga eklemek kap delikten ve şırınga tabanına 0.2μm steril bir şırınga filtre takmak.
   4. Filtre ve parafilm bu yer carbogen bağlayın. Strafor disk / tutucu flakon yerleştirin.
      
      * Mikro-manyetik karıştırıcı hareket edilmelidir.
      * Gaz şişenin içine ZORUNLU.
      * Sıcaklık 34 stabilize ZORUNLU ° C
      
      
7. Diseksiyon hazırlık:
   1. Kaputun altında diseksiyon mikroskobu getirin.
   2. Tüm diseksiyon aletleri, alüminyum folyo Lay% 70 EtOH ile sprey, aşırı kapalı dökün ve kurumaya kaputun altında bırakın.
8. Nöronal orta hazırlayın:
   1. Inkübatör taze nöronal orta 30ml bırakın.
9. 1 büyük alüminyum folyo kare ve 12 küçük kareler yerleştirin. Alüminyum folyo ile baş kesme makası bırakın. Küçük bir strafor kutu buzlu su ile doldurun ve kaput tüm dışında bırakın.
10. Hazırlık anestezi (0.075ml ketamin ve 0.075ml xzylazine).
11. 100 plaka yavrular için en az 12 (P0-P2) alın. Fareler için, bütün çöp için bir genotip maç olduğundan emin olun. Genotipi bilinmeyen ise, ayrı bir kapta her yavru plaka hücreleri, fare numaraları doğru kayıtları tutmak ve onları maç hücre kültürü yemekleri ve glial substrat genetik arka plan hücre kültürleri tektip olduğundan emin olun.

2) Diseksiyon

1. Intraperitoneal enjeksiyonu ile ilk hayvan anestezisi. Hayvan sedasyon gösterir ve tail-flick testi yanıt vermiyor; 30 saniye (hipotermik kadar) buz koyun. Küçük bir alüminyum folyo kare, decap durulayınprogram akreditasyonunun makas, ve% 70 EtOH ile baş.
2. Başını kesmek, kafa alüminyum folyo kare üzerine düşebilir ve kaputun altında taşımak için izin verir. 15ml tüp içine buz gibi soğuk PBS bir beyin yavaşça çıkarın. Sonraki beyin çıkarırken geri buz tüpü yerleştirin.
3. Buz üzerinde 3 beyinleri vardır kadar bu ilk adımları tekrarlayın. Mikroskop altında ilk diseksiyon tabağa 3 beyin ve PBS dökün. Beynin ilgili bölümüne (MCM) çıkarın ve papain sol'n segmentleri koymak için transfer pipetlemeyin kullanabilirsiniz. Ilk bölümler içeri Sayacı başlat
4. Tüm beyinleri papain sindirilir kadar önceki 3 adımları tekrarlayın. Sindirim için ortalama süresi 2 saat olmalıdır. Ilk bölümleri son olanları içeri zaman yaklaşık 1 saat olacak
   
   Fark bölmek deneyin.
   
   
5. * Sindirim sırasında:
   1. Banyo sıcaklığı 34 olduğundan emin olun ° C
   2. Alanlar, ilk bakışta heyecan bar yapışabilir, ama zaman geçtikçe yaymak olmalıdır. Yoksa, flakonun alt dokunun.

3) ezerek toz haline getirme:

1. Bir transfer pipet kullanarak, steril bir 15ml tüp (aşırı papain sol'n önlemek için deneyin) beynin bölümleri aktarmak ve onları inkübatör ısıtılmış glial orta 2ml 3 kez YIKAMA. Tüp içinde glial medya koyduktan sonra, bölümleri segmentler bozmadan yerleşmek ve sonra dikkatle mümkün olduğu kadar çok sol'n kaldırmak için izin verir. Kontaminasyonu önlemek için pipetler değiştirin!
   
   ** Kaldırılır sol'n tutmayın.
   
   
2. Taze bir transfer pipet kullanarak glial medya 2ml triturations başlar. Karışım 25 kez (hava kabarcıkları kiralanmasından önlemek) ve undissociated segmentleri yerleşmek kadar tüp 3 dakika oturup bekleyin. Altındaki segmentleri bozmadan mümkün olduğunca sol'n TUTUN ve kaldırmak için bir transfer pipet kullanın. Yeni bir (steril) 15m tüp süpernatant tutun.
3. 1000μl pipet ve 200μl pipet kullanarak tamamen ayrışmış kadar önceki adımı yineleyin.
4. Bir transfer pipeti ile 10 kez Karışım veya hücreler tamamen sol'n yeniden süspanse kadar.

4) Kaplama Hücreler

1. Forseps her ucu kapsayan, steril bir sarı pipet kullanarak, dikkatli bir şekilde her bir çanak içinde de mümkün olduğunca cam merkezli bir slayt halka bırakın.
2. Hemasitometre ve sayım hücre çözümü 10μl koyun. (Önemsiz kitleler hariç tut).
3. Hücre sayısı 10 ile çarpın. Bu hücre / ml. Bu sayı 1,000,000-1,500,000 (veya istenilen yoğunluk) Böl. Bu çanak ortalama eklemek için ul sayısıdır.
4. Uygun ul / çanak eklemek gibi merkez her yemeğin yüzük slayt pipet kullanın. Hafifçe Plaka ve HER yemek için ipuçları geçiş.
5. 100μl (seyreltilmiş, GDNF sol'n) her yemeğin slayt halka içine ekleyin.
6. Şu anda, inkübatör tepsileri ve soğuk oda nöronal orta getirmek.
7. Hücreleri gecede yerleşmek için izin ver.
8. Ertesi gün: kaldır halkaları (HER yemek için forseps ipuçları kapsayan yeni steril pipet uçları kullanarak)
   

5) Mitotik inhibisyonu: BİR SONRAKİ GÜN

1. 1.8 ml steril MEM 200μl FDU stok ekleyerek 1000X stok 1:10 FDU alikotları sulandırınız.
2. Her yemeğin dışında halka 20μl seyreltilmiş FDU sol'n ekleyin. Pipet uçları sık sık değiştirin. Kapak ve inkübatör dönmek.
   
   * Bir sonraki 7-10 gün için mümkün olduğunca az yemekler Rahatsız. Enfekte yemekleri için kontrol edin ve herhangi bir enfeksiyonun ilk belirtileri enfekte yemekleri kaldırmak. Kültürler 3 hafta içinde test etmek için hazırız.

MEDYA / ÇÖZÜMLER

Nöronal Orta

(200ml için)

Yıkar / öğütme için kullanmadan önce bir gecede şişeler glia klimalı ** En iyi

Bileşen	Miktar	Notlar
BSA% 5	0.5 g	Fraksiyon V
MEM sıvı	94.0 ml	Sigma
DMEM sıvı	80.0 ml	Sigma
F-12 sıvı	20.0 ml	Sigma
Glikoz 45% sıvı	1.50 ml	Sigma çözümü
Glutamin 200mm	0.5 ml	Aliquotted Sigma çözümü
Diporzio Conc.	2.0 ml	Sigma çözümü
Sıvı Katalaz	0.1 ml
0.5M Kynurenic asit	200μl	1N NaOH
HCL 5N	50 ul

1. Bir 250m maddeler (BSA son gider) ile birleştirinl plastik şişe.
2. Filtre, etiket ve buzdolabına kaldırın.

Kynurenic Asit
(FW = 189.2)
0,5 M = 94.6mg/ml
200μl STERİL alikotları 756.8mgKA/8ml 1N NaOH ve pipet: 8 ml stok olun

DiPorzio Medya

A) DiPorzio Conc. Hisse Senetleri:

İHTİYACINIZ			Birleştirmek			Alliquot
Katkı	Çözücü	Tüp	Miktar	ml	ml / tüp	Kons.	Miktar	# Aliq.
İnsülin	20mm HCL (1)	plastik	250mg şişe	10	1	25mg/ml	25mg	10
Transferrin	Hank		500mg şişe	5	1	100mg/ml	100mg	5
SOD	Hank		70mg şişe	14	1	5mg/ml	5mg	14
Putrescine	Hank		50mg	3	0,12	20mg/ml	2.4mg	21
Na 2 SeO 3	Hank		0.104mg	10	0,5	10μg/ml	5.2μg	20
T3	10mM NaOH		2mg	10	0,1	0.20mg/ml	0mg	100
Progesteron	100% EtOH	Cam	12.5mg	10	0,05	1.25mg/ml	Pipetlemeyin kullanın.
Kortizol	100% EtOH	Cam	20mg	10	0,02	2.00mg / ml	Pipetlemeyin kullanın.

1. 20mm HCl = 41.5μl kons. HCl/25ml.
2. 1mg/ml stok yapın ve 10ml için 104μl ekleyin.

B) DiPorzio Medya Stok:

Katkı	Miktarı (ml)	Miktarı (ml) X2	Final Conc. mg / ml	Final Conc. Molarite
Progesteron	0,05	0,1	0,06	200 nm
Kortizol	0,02	0,04	0,04	125nM
Hank BSS	6,21	12,42
İnsülin	1	2	25
Na 2 SeO 3	0,5	1	0,01	30nm
T3	0,1	0,2	0,02	30nm
SOD	1	2	5
Putrescine	0,12	0,24	2,4	15nM
Transferrin	1	2	100

1. 15ml steril tüp polipropilen, progesteron ve kortizol eklemek için kullanın. (Tüp EtOH sıvı aspire için çok dikkatli olmak, yarım ve yerde yarı yolda bozuldu 5ml stripette pipetlemeyin Kimwipes ile güvenli bir şekilde tutun ve sonra ucu getirmek: EtOH buharlaşma hızı, bir aspiratör pipetlemeyin ve vakum kullanın. tüp tarafında bulunan 500μl işareti.
2. Yukarıdaki grafikte göründükleri sırayla sonraki alikotları ekleyin.
3. Sol'n bulutlu yapar insülin, eklenmesinden sonra, pH nötralize etmek için 1N NaOH 20μl ekleyin. Sol'n sarı, pembe ve hemen açık gitmek gerekir. AYRICA, transferin yanı sıra sonra, hemen pH nötralize ve Çökelek oluşumunu önlemek için, 1N NaOH 20μl ekleyin.
4. 5 alikotları (tek parti) bir serolojik pipetlemeyin ve bölme içine 10ml çizin.
5. Store @ -20 ° C
6. 2 toplu bir seferde yapabilir.

Disosiyasyon Medya

A. Papain (1 şişe):

** Sağ diseksiyon önce kaplama güne hazırlayın.

Bileşen	Tutar </ Strong>	(Notlar) Final Conc.
Sistein Su	7.8mL	1mm sistein
Papain	Şişe (* 190μl değişir. 44.0mg/ml)	20 adet / ml (toplam 400 adet sol'n 20ml değerinde)
H & B kons.	2mL
Carbogen	% 95 O2 +% 5 CO2
HCl 5N	10μl
% 0.5 fenol kırmızısı	20μl	% 0.001 '
0.5M Kynurenate	10μl	(1N NaOH) 0.5mm

1. İLK sistein su papain ekleyin.
2. H & B kons. Kynurenate, HCl ve fenol kırmızısı ekleyin.
3. Disosiasyon flakon içine Filtresi (set-up yönde açıklandığı gibi) ve carbogen bağlanmak.
   

B. H & B Konsantre (5X 100 ml):

Malzemeler	MW	Powder/50ml H 2 O	Kons. (M)	Birleştirin (ml)	Final Conc. (MM)
NaCl	58,44	11,699 g	4	14,5	116
KCl	74,56	3,728 g	1	2,7	5,4
NaHCO 3	84,01	4.2 g	1	13	26
NaH 2 PO 4 * H 2 O	137,99	6,90 g	1	1	2
MgSO 4	120,38	6,019 g	1	0,5	1
EDTA (ED2 SS)	292	Sigma% 5 (make 5g/100ml stok)	0,134	0,3722	0,5
Glikoz	180	Sigma 45%	2,5	5	25
TC H 2 O				62,93

1. Miktarlarda stok çözümleri birleştirin.
2. 4ml alikotları içine bölün.
3. Kısım papain ekledikten sonra sistein su ekleyin.
   

C. Sistein Su (1X bir 157.5ml):

Malzemeler	MW	Bileşenleri Toz (mg)	H 2 O (ml)	Stok Conc (mM)	Birleştirin (ml)	Final Conc. (MM)
CaCl 2	147,2	736	10	500	0,6	1.9mM
Sistein	121,7	(1.5)	24	20mm (0.02M)	10	1.27mM (0.88)
TC su					146,9

1. Ve 4, 0,5 M CaCl2 stok sol'n tutmak ° C
2. Sistein bir kullanım sol'n olun ve diğer maddeler ile birleşerek
3. 4 mağaza 15.75 ml ve 10 alikotları içine Böl ° C
   

GDNF Hazırlık

1. Kısım hazırlık:
   1. 2.4mL steril deiyonize su, 5μg GDNF steril, liyofilize pelet çözülür. Bu GDNF sol'n = 2.08μg/mL konsantrasyon.
   2. 2.08μg/mL GDNF sol'n steril cryovials 76.9μl alikotları içine dağıtın. Bu = 160ng vialde.
   3. -20 ° C'de muhafaza
2. Kültürlere Ek:
   1. Her 8 yemekler için 1 kısım çözülme.
   2. 723.1μl nöronal medya / kısım ekleyerek kısım sulandırınız. Bu 160ng/800μl GDNF bir sol'n yapacaktır.
   3. Bu sol'n ml başına 10ng GDNF son bir konsantrasyon için her çanak orta 2mL 100μl ekleyin.
      

FDU Hazırlık

FDU-sol'n 1000X Stok:

Bileşen	Miktar	(Notlar) Final Conc.
Üridin	247 mg	16,5 mg / ml
5-FDU (5 fluorodeoxyuridine)	100 mg (şişe)	6.7 mg / ml
TC Su	15 ml

1. 15 ml 16,5 mg / ml üridin biraz üzerinde olun.
2. 6.7 mg / ml sol'n FDU, 15 ml üridin sol'n FDU 100 mg şişe ekleyin.
3. -20 ° C 200μl alikotları ve donma içine Böl

Kullanım sulandırınız:

1. Non-nöronal hücrelerin büyümesini engeller. 1.8 ml MEM 200μl stok ekleyerek 1000X stok 01:10 sulandırınız.
2. 20μl seyreltilmiş FDU her yemeğin dışında halka ekleyin. Sık sık pipetlemeyin ipuçları değiştirin. Kapak ve inkübatör dönmek.

Discussion

Burada açıklanan yöntemler, aksi bir sistemik veya in vivo yaklaşım mevcut değildir merkezi dopamin nöronlar morfolojik ve nörokimyasal özellikleri ince çözümü için izin .

Materials

Materials are included in the protocol text.