Summary
このビデオでは、ハンギングドロップ法を用いて胚様体には、マウス胚性幹細胞のin vitroでの分化に実施する方法を示しています。
Abstract
幹細胞は多くの異なる細胞型に開発するために驚くべき可能性を秘めている。幹細胞が分裂するとき、それぞれの新しい細胞がどちらの幹細胞を維持またはより専門的な機能を持つ細胞の別の型になる可能性を秘めている、科学のこの有望な、病気を治療するために、細胞ベースの治療の可能性を調査する科学者をリードしています。ときにantidifferentiation因子のない懸濁液中の文化、胚性幹細胞は、自発的に分化し、三次元多細胞集合体を形成する。これらの細胞凝集体は、胚様体（EB）と呼ばれています。ドロップの文化を吊るすことは広く使用されているEBの形成誘導法である。ハンギングドロップの丸みを帯びた底は、EBSを形成するためのMESの細胞に良い環境を提供することができるES細胞の凝集することができます。ハンギングドロップでaggregatied ES細胞の数は、ペトリ皿の蓋からのドロップとしてハングアップしているように初期の細胞懸濁液中の細胞の数を変えることによって制御できます。このメソッドを使用して我々は、再現性ES細胞の所定の数から均質なEBSを形成することができます。
Protocol
- 前に37℃、5％CO 2組織培養インキュベーターで一晩一日に0.1％ゼラチン溶液とインキュベートプレートを使用してT75フラスコをゼラチン状にする。
- 、インキュベートからMESの細胞を取り出し、培地を吸引除去し、PBSでES細胞培養をすすぎ、皿のコート底を（2 ml/100mmプレート）に0.05％トリプシン溶液を加える。
- 細胞がプレートを脱却するまで、37℃で約1分間インキュベートする。
- 静かに、接続されてパスツールピペットを持つES細胞を分散させるために4〜6回（ピペットの上下）トリプシン処理細胞をひいて粉にする。温めておいた（37℃）MESの培地を含む15 mlのコニカル遠心チューブに分散したES細胞を移す。
- 遠心分離により細胞を収集する。 、上清を吸引するMESの培地10mlを追加し、単一の細胞懸濁液を形成するために上下にピペッティング。
- 37℃で0.1％のゼラチンおよびインキュベーションをプレコートT75フラスコに細胞懸濁液を移す℃で1時間5％CO 2で
* 1時間後、線維芽細胞はプレートに取り付けられているが、幹細胞は、培地中に残ります。幹細胞を収集するための培地をピペッティング。 - 5分間1000rpmで細胞をスピンし、MESの培地をオフに吸引除去する。その後、MESの分化培地の別の10 mlを追加したり、セルの微細な懸濁液があるように表示されるまで、反復的なピペッティングにより細胞を再懸濁します。
- 滅菌流域における20ul（20ul/drop）あたり400〜500細胞の濃度に幹細胞懸濁液を希釈するために血球計算板の使用の分化培地で細胞をカウント。
- 蓋を持ち上げ、慎重にそれを反転し、10mlのPBSを含む皿の上に置きます。マルチチャンネルピペットを使用して、組織培養皿の蓋の上から転身内面に20ul滴の行を作る。
- 慎重に2日間インキュベーターで皿を置きます。 2日後、慎重に、プレートカバーをめくり180 ulの新鮮な分化培地を吸引し、96ウェル超低アタッチメントプレートのウェルに数滴を入れて。その後ピペットと転送滴、一人ずつ、96ウェルプレートへとピックアップドロップを。 3日間静インキュベーターにプレートを置きます。
- コート0.1％ゼラチンの300ulと48ウェル組織培養プレートの各ウェルに。 EBSを転送する前にゼラチンを添加した後、℃、一日前に37℃で一晩インキュベートする。
- 翌日、48ウェルプレートからゼラチンを吸引除去する。次に、各ウェルに分化培地の300 ulを加える。 96ウェルプレートから48ウェルゼラチンコートプレート一つずつにEBSを転送する。翌日培地を変更してから細胞を維持するために一日おきに培地を変更してください。
- 自発cardiaomyocyte収縮は7日以内に明らかにする必要があります。
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Discussion
滴の液量は、表面張力によって蓋の上にぶら下がって降下を維持するために以下50ULに限定されており、それがドロップを干すための培地を変更することは不可能だ：ハンギングドロップ法の短所は次のとおりです。顕微鏡で直接滴でEBSを形成するの観察は、栽培中にも非常に困難である。さらにもっと、ハンギングドロップ法は、次の2つの手順で構成され、従って、ハンギングドロップ法のステップのシリーズは、面倒かもしれません。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
