Summary
इस वीडियो को दर्शाता है कैसे माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं की इन विट्रो भेदभाव में embryoid निकायों को फांसी ड्रॉप विधि का उपयोग आचरण.
Abstract
स्टेम सेल उल्लेखनीय कई अलग अलग प्रकार की कोशिकाओं में विकसित करने की क्षमता है. जब एक स्टेम सेल बिताते हैं, प्रत्येक नया सेल करने के लिए या तो एक स्टेम सेल रह सकता है या एक अधिक विशिष्ट समारोह के साथ सेल का एक प्रकार बन क्षमता है, विज्ञान के इस होनहार वैज्ञानिकों सेल आधारित चिकित्सा की संभावना की जांच करने के लिए बीमारी का इलाज अग्रणी है. जब antidifferentiation कारकों के बिना निलंबन संस्कृति में, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं अनायास अंतर और तीन आयामी multicellular समुच्चय के रूप में. ये सेल समुच्चय embryoid निकायों (EB) कहा जाता है. हैंगिंग ड्रॉप संस्कृति एक व्यापक रूप से इस्तेमाल किया EB गठन प्रेरण विधि है. फांसी बूंद के गोल नीचे ES कोशिकाओं का एकत्रीकरण जो एमईएस कोशिकाओं बनाने ईबीएस के लिए एक अच्छा माहौल प्रदान कर सकते हैं अनुमति देता है. एक फांसी ड्रॉप में aggregatied ES कोशिकाओं की संख्या प्रारंभिक सेल पेट्री डिश के ढक्कन से एक बूंद के रूप में लटका दिया जा निलंबन में कोशिकाओं की संख्या अलग से नियंत्रित किया जा सकता है. इस पद्धति का उपयोग करके हम reproducibly ES कोशिकाओं के एक पूर्व निर्धारित संख्या से सजातीय ईबीएस फार्म कर सकते हैं.
Protocol
- T75 एक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2 टिशू कल्चर इनक्यूबेटर रातोंरात एक दिन पहले में 0.1% जिलेटिन समाधान और सेते प्लेट का उपयोग कर फ्लास्क सरेस लगाना.
- एमईएस कोशिकाओं से सेते ले लो, मध्यम aspirate, पीबीएस के साथ ES सेल संस्कृति कुल्ला करने के लिए, 0.05% trypsin समाधान जोड़ने के पकवान के नीचे कोट (2 ml/100mm थाली) के लिए.
- 37 डिग्री लगभग 1 मिनट के लिए सी सेते हैं, जब तक कोशिकाओं से थाली sloughing हैं.
- धीरे triturate (pipet और नीचे) trypsinized कोशिकाओं चार से छह बार एक खामियों को दूर पाश्चर विंदुक के साथ ES कोशिकाओं को फैलाने के लिए. 15 मिलीलीटर शंक्वाकार अपकेंद्रित्र prewarmed (37 डिग्री सेल्सियस) एमईएस मध्यम युक्त ट्यूब में बिखरे ES कोशिकाओं स्थानांतरण.
- Centrifugation द्वारा कोशिकाओं लीजिए. सतह पर तैरनेवाला Aspirate, एमईएस माध्यम के 10 मिलीलीटर जोड़ें और ऊपर और नीचे एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में विंदुक.
- एक T75 के साथ 0.1% जिलेटिन और सेते पूर्व लेपित फ्लास्क में 37 में सेल निलंबन ° स्थानांतरण सी एक घंटे के लिए 5% सीओ 2 के साथ
* एक घंटे के बाद, fibroblasts थाली करने के लिए संलग्न है, लेकिन स्टेम कोशिकाओं मध्यम में रहते हैं. स्टेम कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए मध्यम पिपेट. - 5 मिनट के लिए 1000 rpm पर कोशिकाओं को घुमाओ और बंद एमईएस मध्यम aspirate. फिर एमईएस भेदभाव माध्यम के एक 10 मिलीलीटर जोड़ने और दोहराव pipetting द्वारा कोशिकाओं resuspend जब तक वहाँ के लिए कक्षों की एक ठीक निलंबन प्रतीत होता है.
- एक hemocytometer उपयोग भेदभाव माध्यम से कोशिकाओं की गणना के लिए एक बाँझ बेसिन में 400 से 500 प्रति 20ul (20ul/drop) कोशिकाओं के एक एकाग्रता के लिए स्टेम सेल निलंबन पतला.
- ढक्कन लिफ्ट, ध्यान से यह पलटना और पीबीएस के 10 मिलीलीटर युक्त डिश के शीर्ष पर यह जगह. एक multichannel विंदुक का प्रयोग, टिशू कल्चर पकवान के ढक्कन के ऊपर बने भीतरी सतह पर 20ul बूंदों की पंक्तियाँ बनाते हैं.
- ध्यान इनक्यूबेटर में 2 दिनों के लिए पकवान जगह है. दो दिनों के बाद, ध्यान से प्लेट कवर पर बारी, 180 उल ताजा भेदभाव मध्यम aspirate और ultralow 96 अच्छी तरह से लगाव थाली का अच्छी तरह से में कई बूँदें डाल. विंदुक और हस्तांतरण बूँदें, एक एक करके, 96 अच्छी तरह से थाली के साथ ड्रॉप पिक तो. 3 दिनों के लिए undisturbed इनक्यूबेटर में प्लेटें प्लेस.
- प्रत्येक की अच्छी तरह से 300ul 0.1 जिलेटिन% के साथ 48-अच्छी तरह से ऊतक संस्कृति की थाली कोट. जेलाटीन जोड़ने के बाद, 37 पर थाली रातोंरात सेते डिग्री सेल्सियस एक दिन आगे से पहले ईबीएस हस्तांतरण.
- अगले दिन, 48-अच्छी तरह से थाली से जिलेटिन aspirate. फिर प्रत्येक अच्छी तरह से भेदभाव के माध्यम से 300 उल जोड़ें. ईबीएस 96 अच्छी तरह प्लेटें से 48 अच्छी तरह से जिलेटिन लेपित एक से एक प्लेटों पर स्थानांतरण. मध्यम अगले दिन बदलें और फिर हर दूसरे दिन मध्यम बदलने के लिए कोशिकाओं को बनाए रखने.
- स्वतःस्फूर्त cardiaomyocyte संकुचन 7 दिनों के भीतर स्पष्ट किया जाना चाहिए.
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Discussion
फांसी ड्रॉप विधि के नुकसान के रूप में निम्नानुसार हैं: एक बूंद के तरल मात्रा 50ul कम से कम करने के लिए सीमित की वजह से सतह तनाव द्वारा ढक्कन पर फांसी बूँदें बनाए रखने के लिए, और यह असंभव है बूँदें फांसी के लिए मध्यम को बदलने. माइक्रोस्कोपी के साथ सीधे बूंदों में ईबीएस बनाने के अवलोकन से भी खेती के दौरान बहुत मुश्किल है. और इसके अलावा, फांसी ड्रॉप विधि दो चरणों के होते हैं, इसलिए फांसी ड्रॉप विधि के कदम की एक श्रृंखला परेशानी हो सकता है.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
