Summary
В этом видеоролике показано, как проводить в пробирке дифференциации мышиных эмбриональных стволовых клеток эмбриоидных органов использовании висячей капли метод.
Abstract
Стволовые клетки обладают замечательными возможностями для развития в различные типы клеток. Когда стволовых клетка делится, каждая новая клетка имеет потенциал, чтобы либо остаются стволовых клеток или стать другой тип клетки с более специализированные функции, этот перспективный науки является ведущим ученым исследовать возможности клеточной терапии для лечения болезней. Когда культура во взвешенном состоянии без antidifferentiation факторов, эмбриональные стволовые клетки спонтанно дифференцироваться и образуют трехмерные многоклеточные агрегаты. Эти клеточные агрегаты называются эмбриоидные тела (ИС). Висячей капли культура широко используется EB формирование индукционным методом. Округлой нижней висячей капли позволяет агрегации ЭС клеток, которые могут обеспечить МЧС клетки хорошую среду для формирования ЭТ. Число ЭС клеток aggregatied в висячей капли можно управлять, варьируя количество клеток в исходной суспензии ячейки, чтобы висеть в виде капли на крышке чашки Петри. С помощью этого метода мы можем воспроизводимо образуют однородные ЭТ из определенного количества ЭС клеток.
Protocol
- Желировать T75 колбу использованием 0,1% раствора желатина и инкубировать пластины в 37 ° С, 5% СО 2 инкубатора культуры тканей ночь один день раньше.
- Выньте МЧС клетки инкубировать, аспирация среда, полоскание культуры ЭСК с PBS, добавить 0,05% раствора трипсина, чтобы покрыть дно тарелки (2 ml/100mm пластины).
- Инкубировать при 37 ° С в течение примерно 1 минуты, пока клетки отторжения от пластины.
- Аккуратно растирают (пипетки вверх и вниз) трипсином клетки четыре-шесть раз, чтобы разогнать ЭС клетки с подключено пипетки Пастера. Передача рассеяны ЭС клеток в 15-мл коническую трубку центрифуги содержащие предварительно нагретого (37 ° С) МЧС среды.
- Сбор клетки центрифугированием. Аспирируйте супернатант, добавить 10 мл среды МЧС и пипетку вверх и вниз для формирования суспензии отдельных клеток.
- Передача клеточной суспензии в T75 колбу предварительно покрытых с 0,1% желатина и инкубировать при температуре 37 ° C с 5% CO 2 в течение одного часа
* Через час фибробластов приложил к пластине, а стволовые клетки остаются в среду. Внесите до среды для сбора стволовых клеток. - Спиновые клетки при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин и аспирации от среды МЧС. Затем добавить еще 10 мл среды дифференциации МЧС и ресуспендирования клеток повторяющихся пипетки, пока, кажется, прекрасно суспензии клеток.
- Граф клеток с дифференциацией среды использования гемоцитометра разбавить подвески стволовых клеток в концентрации от 400 до 500 клеток в 20 мкл (20ul/drop) в стерильных бассейна.
- Поднимите крышку, осторожно инвертировать его и поместите его на самый верх блюда, содержащие 10 мл PBS. Использование многоканальной пипетки, чтобы выстроить линию из 20 мкл капель на последнюю оказалось внутренней поверхности крышки блюдо культуры ткани.
- Осторожно поместите блюдо в инкубаторе в течение 2 дней. После двух дней, аккуратно перевернуть крышкой, аспирация 180 ул свежей среды, дифференциацию и положить несколько капель в колодец 96-луночного планшета привязанности сверхнизких. Затем пикап капли с пипеткой и передачи данных падает, один за одним, к 96-луночного планшета. Место тарелки в инкубаторе в покое на 3 дня.
- Пальто каждую лунку 48-луночного культуре ткани пластины с 300ul 0,1% желатина. После добавления желатина, инкубировать пластине в течение ночи при 37 ° С на сутки вперед до передачи EBS.
- На следующий день, аспирации желатин от 48-луночного планшета. Затем добавьте 300 мкл дифференциации среды в каждую лунку. Передача ЭТ из 96-луночных на 48 и желатин пластинками, покрытыми один за одним. Изменение среды на следующий день, а затем изменить среду через день, чтобы поддерживать клетки.
- Спонтанное cardiaomyocyte сокращения должны быть очевидны в течение 7 дней.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Недостатками метода висячей капли в следующем: жидкий объем капли ограничивается менее 50ul из-за поддержания висит капель на крышку, поверхностного натяжения, и это невозможно изменить среду для подвешивания капель. Наблюдение формирования ЭТ в виде капель непосредственно с микроскопии также очень трудно в процессе культивирования. Более того, метод висячей капли состоит из двух этапов, поэтому серия шаг висячей капли метод может быть хлопотным.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
