Summary
Denna video visar hur du utföra in vitro-differentiering av mus-embryonala stamceller till embryoid organ med hängande släpp-metoden.
Abstract
Stamceller har den anmärkningsvärda potential att utvecklas till många olika celltyper. När en stamcell delar sig har varje ny cell potential att antingen förbli en stamcellstransplantation eller bli en annan typ av cell med en mer specialiserad funktion, är detta lovande vetenskapens ledande forskare att undersöka möjligheten av cellbaserade terapier för behandling av sjukdomen. När kultur i avstängning utan antidifferentiation faktorer, embryonala stamceller skiljer spontant och bildar tredimensionella flercelliga aggregat. Dessa cellaggregat kallas embryoid organ (EB). Droppe kultur är en allmänt använd EB bildandet induktion metod. Den rundade botten droppe tillåter aggregering av ES-celler som kan ge MES celler en god miljö för att bilda EBS. Antalet ES-celler aggregatied i en droppe kan kontrolleras genom att variera antalet celler i den inledande cellsuspension att hängas som en droppe från locket på en petriskål. Med denna metod kan vi reproducerbart bilda homogena EB från ett förutbestämt antal ES-celler.
Protocol
- Gelatinize T75 kolven med hjälp av en 0,1% gelatin-lösning och inkubera plattan i 37 ° C, 5% CO 2 vävnadsodling inkubator natten en dag innan.
- Ta ut MES celler från inkubera, aspirera mediet, skölj kultur ES-celler med PBS, lägg till 0,05% trypsin lösning att belägga botten av skålen (2 ml/100mm tallrik).
- Inkubera vid 37 ° C i ca 1 minut, tills cellerna avskedandet plattan.
- Försiktigt mal sönder (Pipettera upp och ner) den trypsinized celler fyra till sex gånger för att skingra ES-celler med en ansluten pasteurpipett,. Överför spridda ES-celler i ett 15-ml koniskt centrifugrör innehållande uppvärmd (37 ° C) MES medium.
- Samla cellerna genom centrifugering. Aspirera supernatanten, tillsätt 10 ml av MES medelstora och pipett upp och ner för att bilda en enda cell suspension.
- Överför cellsuspension i en T75 kolv redan belagda med 0,1% gelatin och inkubera vid 37 ° C med 5% CO 2 i en timme
* Efter en timme har fibroblaster fäst vid plattan, men stamceller kvar i mediet. Pipettera upp mediet för att samla stamceller. - Snurra cellerna vid 1000 rpm i 5 minuter och aspirera från MES medium. Tillsätt därefter ytterligare 10 ml MES differentiering medium och återsuspendera cellerna repetitiva pipettering tills det verkar vara en fin suspension av celler.
- Räkna celler med en hemocytometer använda differentiering medel för att späda ut suspensionen stamceller till en koncentration av 400 till 500 celler per 20ul (20ul/drop) i en steril bassäng.
- Lyft locket, försiktigt invertera den och placera den på toppen av skålen innehåller 10 ml PBS. Med hjälp av en flerkanalspipett, göra rader av 20ul droppar på upp-vände insidan av locket på vävnadsodling skålen.
- Placera försiktigt skålen i inkubatorn i 2 dagar. Efter två dagar, försiktigt vända plattan täcka, aspirera 180 ul färska differentiering medellång och satte flera droppar i brunnen av en 96-håls ultralåga fästplattan. Sedan pickup nedgången med pipetten och överföra droppar, en i taget, till den 96-brunnar. Placera plattorna i inkubatorn ostört i 3 dagar.
- Coat varje brunn i en 48-såväl vävnadsodling tallrik med 300ul på 0,1% gelatin. När du lagt till gelatin, Inkubera plattan över natten vid 37 ° C en dag kvar innan överföra EBS.
- Nästa dag aspireras gelatin från 48-brunnar. Tillsätt sedan 300 ul av differentiering medium till varje brunn. Överför EBS från 96 brunnar till 48 väl gelatin-plåt en efter en. Ändra mediet nästa dag och sedan ändra på medellång varannan dag för att upprätthålla cellernas.
- Spontan cardiaomyocyte sammandragningar bör vara tydlig inom 7 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Nackdelarna med hängande släpp-metoden är följande: den flytande volym av en droppe är begränsad till mindre än 50ul grund för att upprätthålla hänger droppar på locket genom ytspänning, och det är omöjligt att ändra medium för hängande droppar. Observation bilda strandsandaler droppar direkt med mikroskopi är också mycket svårt under odlingen. Vidare består droppe metoden i två steg, därför kan ett antal steg i droppe metoden vara besvärande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
