Summary
本视频演示了如何在小鼠胚胎干细胞体外分化胚体采用悬滴法进行。
Abstract
干细胞具有显着的潜力发展成许多不同的细胞类型。当一个干细胞分裂时，每个新细胞的潜力仍然是一个干细胞，或成为另一个类型的细胞与一个更专业的功能，这是有前途的科学顶尖科学家研究细胞疗法来治疗疾病的可能性。当没有暂停antidifferentiation因素文化时，胚胎干细胞自发分化和形成立体的多细胞聚集。这些细胞聚集被称为胚体（EB）。悬滴文化是一种广泛使用的EB形成诱导方法。悬滴的圆形底部，使胚胎干细胞，它可以提供一个良好的环境，形成EBS mES细胞的聚集。在悬滴aggregatied的ES细胞的数量是可以控制的不同细胞的数量在最初的细胞悬液，将挂在培养皿的盖子下降。使用这种方法，我们可以再现的形式从同质分化的ES细胞的预定人数。
Protocol
- 涂胶T75烧瓶中，在37℃，5％的CO 2组织培养箱培养过夜之一的前一天使用0.1％的明胶溶液和孵化板。
- 取出孵化mES细胞，吸出培养基，用PBS冲洗胚胎干细胞培养，加入0.05％胰蛋白酶溶液大衣的菜（2 ml/100mm板）底部。
- 孵育在37 ° C约1分钟，待细胞塌板。
- 轻轻磨碎（吸管向上和向下）的4至6倍，以分散与巴斯德吸管插入的ES细胞的胰酶消化细胞，。分散的ES细胞转移到15毫升锥形离心管预热（37℃）MES中等。
- 离心收集细胞。吸弃上清液，加入10毫升的MES培养基和吸管向上和向下，形成一个单细胞悬液。
- 转移细胞悬液，在37 °成T75容量瓶中，用0.1％的明胶和孵化预涂C的5％CO 2为一小时
*一小时后，成纤维细胞附着到板材，但干细胞的培养基中保持。移液器中期收集干细胞。 - 在5分钟1000转的旋转细胞和吸MES的介质。然后添加另一个MES分化培养基10毫升和重复吹打重悬细胞，直到出现被罚款的细胞悬浮液。
- 计数与血球使用分化培养基中的细胞，干细胞悬液，以稀释浓度20ul（20ul/drop）的400至500个细胞，在无菌盆地。
- 提起盖子，小心地倒置和地方菜含有10毫升的PBS上。使用多道移液器，20ul滴行的组织培养皿的盖子向上翻内表面上。
- 2天，小心地在孵化器的菜。两天后，仔细地翻板盖，吸180 UL新鲜分化培养基放入96孔超低附件板以及数滴。然后用吸管和转让滴，一个接一个，96孔板皮卡下降。放入3天的孵化器不受干扰的板块。
- 大衣，每孔48孔组织培养板，0.1％的明胶300ul。加入明胶后，板一夜之间在37 ° C提前一天之前转移的EBS。
- 第二天，从48孔板吸明胶。然后分化培养基加入300 UL每口井。从96孔板的EBS转移到48以及明胶涂层板一。更改介质的第二天，然后改变中期隔日维持细胞。
- 自发cardiaomyocyte收缩应在7天明显。
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Discussion
悬滴法的缺点如下：不超过50ul，由于维持表面张力的盖子上悬滴一滴的液体的体积是有限的，它不可能改变中期挂滴。形成胚滴直接用显微镜观察也很难在种植。更进一步，悬滴法是由两个步骤组成，因此，悬滴法的一系列步骤可能会很麻烦。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
