Summary
Cette vidéo montre comment effectuer la différenciation in vitro de cellules souches embryonnaires de souris aux corps embryoïdes utilisant la méthode de la goutte pendante.
Abstract
Les cellules souches ont le potentiel remarquable pour développer dans de nombreux types cellulaires différents. Quand une cellule souche se divise, chaque nouvelle cellule a le potentiel de demeurer une cellule souche ou devenir un autre type de cellule avec une fonction plus spécialisée, ce prometteur de la science est à la tête des scientifiques pour étudier la possibilité de thérapies cellulaires pour traiter la maladie. Lorsque la culture en suspension sans facteurs antidifferentiation, les cellules souches embryonnaires spontanément différencier et former en trois dimensions des agrégats multicellulaires. Ces agrégats cellulaires sont appelés corps embryoïdes (EB). Culture en suspension de chute est une méthode largement utilisée EB formation de l'induction. Le fond arrondi de la goutte suspendue permet l'agrégation des cellules ES qui peuvent fournir des cellules MES un bon environnement pour former EBS. Le nombre de cellules ES aggregatied dans une goutte suspendue peut être contrôlée en faisant varier le nombre de cellules dans la suspension cellulaire initiale à être accroché comme une goutte sur le couvercle de la boîte de Pétri. En utilisant cette méthode, nous pouvons reproductible forme homogène EB à partir d'un nombre prédéterminé de cellules ES.
Protocol
- Gélatiniser flacon T75 en utilisant une solution à 0,1% de gélatine et de la plaque incuber dans une 37 ° C, le CO 2 de la culture incubateur à 5% du tissu nuit un jour avant.
- Sortez les cellules d'incubation MES, aspirer le milieu, rincer la culture de cellules ES avec PBS, ajouter la solution de trypsine 0,05% à recouvrir le fond du plat (2 plaques ml/100mm).
- Incuber à 37 ° C pendant environ 1 minute, jusqu'à ce que les cellules sont desquamation de la plaque.
- Doucement triturer (pipette de haut en bas), les cellules trypsinisées quatre à six fois pour disperser les cellules ES avec une pipette Pasteur branché,. Transférer les cellules ES dispersés dans un tube de 15 ml à centrifuger conique contenant préchauffée (37 ° C) moyenne MES.
- Recueillir les cellules par centrifugation. Aspirer le surnageant, ajouter 10 ml de milieu de MES et la pipette de haut en bas pour former une suspension cellulaire unique.
- Transférer la suspension cellulaire dans un flacon T75 pré-enduites de gélatine à 0,1% et incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2 pendant une heure
* Après une heure, les fibroblastes ont attaché à la plaque, mais les cellules souches restent dans le milieu. Pipeter le moyen de recueillir les cellules souches. - Faites tourner les cellules à 1000 rpm pendant 5 min et aspirer hors du milieu MES. Puis ajouter un autre 10 ml de milieu de différenciation MES et remettre les cellules par pipetage répétitifs jusqu'à ce qu'il semble y avoir une suspension fine de cellules.
- Compter les cellules avec un milieu de différenciation hémocytomètre utiliser pour diluer la suspension de cellules souches à une concentration de 400 à 500 cellules par 20ul (20ul/drop) dans un bassin de stériles.
- Soulevez le couvercle soigneusement l'inverser et la placer sur le dessus du plat contenant 10 ml de PBS. En utilisant une pipette multicanaux, faire des rangées de gouttes sur la surface de 20ul retroussé intérieure du couvercle de la boîte de culture tissulaire.
- Placez délicatement le plat dans l'incubateur pendant 2 jours. Après deux jours, soigneusement tourner sur la plaque de couverture, aspirez 180 ul moyenne de différenciation fraîche et mettre quelques gouttes dans le puits d'une plaque de 96 puits ultra attachement. Puis le micro de la goutte avec les gouttes de pipette et de transfert, un par un, à la plaque de 96 puits. Placer les plaques dans le reposer pendant 3 jours d'incubation.
- Enrober chaque puits d'une plaque de 48 puits de culture de tissu avec 300ul de 0,1% de gélatine. Après l'ajout de la gélatine, incuber la plaque pendant la nuit à 37 ° C un jour en avance avant le transfert de l'EBS.
- Le lendemain, aspirer les feuilles de gélatine de la plaque de 48 puits. Puis ajouter 300 ul de milieu de différenciation à chaque puits. Transfert l'EBS de la plaque de 96 puits aux 48 et la gélatine des plaques revêtues un par un. Changer le support le jour suivant et ensuite changer le milieu tous les autres jours pour maintenir les cellules.
- Spontanée contractions cardiaomyocyte devrait être évident dans les 7 jours.
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Discussion
Les inconvénients de la méthode de la goutte suspendue sont les suivants: le volume de liquide d'une baisse est limitée à moins de 50ul due au maintien de gouttes suspendues sur le couvercle par la tension de surface, et il est impossible de changer le milieu des gouttes pendantes. Observation de former EBS gouttes directement avec la microscopie est également très difficile pendant la culture. Plus loin plus, la méthode de la goutte suspendue compose de deux étapes, par conséquent, une série d'étapes de la méthode de la goutte suspendue peut être gênant.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
