Summary
هذا الفيديو يوضح كيفية السلوك في المختبر من تمايز الخلايا الجذعية الجنينية للهيئات مضغي الشكل باستخدام طريقة قطرة شنقا.
Abstract
الخلايا الجذعية لديها القدرة على تطوير ملحوظ في العديد من أنواع مختلفة من الخلايا. عندما يقسم الخلايا الجذعية ، فإن كل خلية جديدة لديها القدرة على البقاء إما أو تصبح الخلايا الجذعية نوع آخر من الخلايا ذات وظيفة أكثر تخصصا ، وهذا العلم هو واعد كبار العلماء لدراسة إمكانية خلية مقرها العلاجات لعلاج المرض. عندما الثقافة في الوقف بدون عوامل antidifferentiation ، والخلايا الجذعية الجنينية تفرق بشكل عفوي وشكل ثلاثي الأبعاد مجاميع متعددة الخلايا. وتسمى هذه المجاميع الخلية الهيئات مضغي الشكل (EB). اعدام ثقافة الإفلات من تشكيل EB المستخدمة على نطاق واسع طريقة الاستقراء. الجزء السفلي من قطرة شنقا تقريب يسمح تجميع الخلايا ES الخلايا التي يمكن أن توفر بيئة جيدة زارة التربية والعلم لتشكيل EBS. يمكن السيطرة على عدد من الخلايا ES aggregatied في انخفاض شنقا متفاوتة عدد من الخلايا في خلية تعليق أولي على أن تكون معلقة على قطرة من غطاء طبق بيتري. باستخدام هذا الأسلوب يمكن أن نشكل بتكاثر EBS متجانسة من عدد محدد مسبقا من الخلايا ES.
Protocol
- يهلم T75 القارورة باستخدام محلول 0.1 ٪ الجيلاتين واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية ، و 5 ٪ CO 2 زراعة الأنسجة حاضنة قبل يوم واحد بين عشية وضحاها.
- أخرج من احتضان خلايا MES ، نضح المتوسط ، شطف خلية ثقافة وفاق مع برنامج تلفزيوني ، إضافة 0.05 ٪ إلى حل التربسين معطف أسفل الطبق (2 صفيحة ml/100mm).
- احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة ما يقرب من 1 دقيقة ، حتى الخلايا هي النزع قبالة لوحة.
- متمزج بلطف (الماصة صعودا وهبوطا) الخلايا trypsinized أربع إلى ست مرات لتفريق الخلايا وفاق مع ماصة باستير توصيله. نقل الخلايا ES فرقت في أنبوب 15 مل تحتوي على أجهزة الطرد المركزي المخروطية prewarmed (37 درجة مئوية) MES المتوسطة.
- جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي. نضح لطاف ، أضف 10 مل من وزارة التربية والعلم المتوسطة ماصة صعودا وهبوطا لتشكيل تعليق خلية واحدة.
- نقل تعليق خلية في قارورة T75 قبل المغلفة مع 0.1 ٪ في الجيلاتين واحتضان 37 درجة مئوية مع نسبة 5 ٪ CO 2 لمدة ساعة واحدة
* بعد ساعة واحدة ، قد أولت الليفية إلى لوحة الخلايا الجذعية ولكن تبقى في المتوسط. ماصة يصل المتوسط لجمع الخلايا الجذعية. - تدور الخلايا في 1000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق ، ونضح قبالة المتوسطة زارة التربية والعلم. ثم يضاف 10 مل أخرى من المتوسطة وزارة التربية والعلم تمايز الخلايا عن طريق resuspend pipetting المتكررة حتى يبدو أن هناك تعليق غرامة من الخلايا.
- عدد الخلايا التي تحتوي على التفريق المتوسطة عدادة الكريات تستخدم لتخفيف تعليق الخلايا الجذعية إلى التركيز بين 400 إلى 500 خلية لكل 20ul (20ul/drop) في حوض العقيمة.
- رفع الغطاء ، عكس بعناية ووضعه على قمة من صحن يحتوي على 10 مل من برنامج تلفزيوني. باستخدام ماصة الأقنية ، وجعل الصفوف من قطرات 20ul على السطح حتى تحول الداخلي للغطاء من النسيج صحن الثقافة.
- المكان بعناية الطبق في الحاضنة لمدة 2 ايام. بعد يومين ، بدوره بعناية على مدى غطاء لوحة ، ونضح 180 UL متوسطة التمايز الطازجة ووضع عدة قطرات في البئر لوحة ultralow مرفق 96 - جيدا. ثم تراجع لاقط مع قطرات ماصة ونقلها ، واحدة تلو الأخرى ، لوحة 96 - جيدا. وضع لوحات في الحاضنة لمدة 3 أيام دون عائق.
- معطف كل بئر لزراعة الأنسجة 48 لوحة جيدا مع 300ul من 0.1 ٪ الجيلاتين. بعد إضافة الجيلاتين ، واحتضان لوحة ليلا 37 درجة مئوية قبل يوم واحد قبل نقل EBS.
- في اليوم التالي ، نضح في الجيلاتين من 48 لوحة جيدا. ثم يضاف 300 UL متوسطة التمايز إلى كل بئر. نقل الصفائح الحديدية من 96 إلى جانب لوحات 48 الجيلاتين المغلفة جيدا واحدة تلو الأخرى. تغيير المتوسطة في اليوم التالي ثم تغيير المتوسط كل يوم للحفاظ على الخلايا.
- وينبغي أن تقلصات cardiaomyocyte عفوية يكون واضحا في غضون 7 أيام.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مساوئ أسلوب قطرة شنقا هي كما يلي : يقتصر حجم السائل لتنخفض إلى أقل من 50ul بسبب الحفاظ على قطرات المعلقة على غطاء من التوتر السطحي ، وانه من المستحيل تغيير وسيلة لتعليق قطرات. الملاحظة تشكيل EBS في قطرات مباشرة مع المجهري هو أيضا من الصعب جدا خلال زراعة. مزيد المزيد ، وطريقة قطرة شنقا يتكون من خطوتين ، وبالتالي ، قد يكون خطوة من سلسلة من الأسلوب قطرة شنقا يكون مزعجا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) | Reagent | Hyclone | SH30070.03 | |
| L-Glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Non-Essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| Penicllin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Sodium Pyruvate | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11360-70 | |
| β-mercapt–thanol | Reagent | Chemicon International | ES-007-E | |
| leukemia inhibitory factor(LIF) | Reagent | Chemicon International | LIF2005 | |
| 96-well ultralow attachment plate | Tool | Corning | 3474 |
References
- Wobus, A. M., Wallukat, G., Hescheler, J. Pluripotent mouse embryonic stem cells are able to differentiate into cardiomyocytes expressing chronotropic responses to adrenergic and cholinergic agents and Ca2+ channel blockers. Differentiation. 48, 173-182 (1991).
- Metzger, J. M., Lin, W. I., Samuelson, L. C. Transition in cardiac contractile sensitivity to calcium during the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. J Cell Biol. 126, (1994).
