Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

В пробирке Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток для магнитно-резонансная томография

doi: 10.3791/827 Published: August 3, 2008

Summary

В этом видео, мы показываем, как этикетка человеческих эмбриональных стволовых клеток (чЭСК) с хлористого марганца (MnCl

Abstract

Человека эмбриональные стволовые клетки (чЭСК) продемонстрировали возможность восстановления ранения миокарда. Магнитно-резонансная томография (МРТ) стала одной из преобладающих форм изображений в целях оценки восстановления ранения миокарда. Кроме того, экс-маркировки естественных агентов, таких как железо-оксидных наночастиц, были использованы для отслеживания и локализации пересаженных стволовых клеток. Однако этот метод не контролирует основных клеточных собственности биологии относительно жизнеспособности пересаженных клеток. Было известно, что хлористого марганца (MnCl 2) входит в клетки с помощью напряжения закрытого кальция (Са 2 +) каналов, когда клетки являются биологически активными и накапливаются внутриклеточно генерировать T 1 сокращения эффекта. Таким образом, мы предполагаем, что марганец наведением МРТ может быть полезно для контроля жизнеспособности клеток после трансплантации чЭСК в миокарде.

В этом видеоролике мы покажем, как на этикетке чЭСК с MnCl 2 и как эти клетки могут быть хорошо видны с помощью МРТ в пробирке. В то же время, биологическая активность Са 2 +-каналов будет модулированного использованием как Са 2 +-канала агонистов и антагонистов для оценки сопутствующих изменений сигнала.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Марганец Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток

  1. Trypsinize человеческих эмбриональных стебли, которые были культивировали в фидерных свободных условиях в течение 5 минут. Нейтрализовать трипсина путем добавления питательных сред.
  2. Спином вниз клетки центрифугированием при 800 оборотов в минуту в течение 5 минут при 20 ° по Цельсию. После повторного приостановления осадок клеток, подсчет числа клеток трипанового синего окрашивания. На основе клеток получены, делятся клетки на четыре порции 3 млн. клеток в конических труб. Гранул клетки снова с помощью центрифугирования.
  3. Просто перед началом марганца маркировки, растворить свежий хлористого марганца с 0,9% раствор натрия хлорида, чтобы сделать 0.1мм марганца раствор хлорида.
  4. Для того чтобы наблюдать активность кальциевых каналов, четыре образца были готовы. Первая проба нашего контроля, которая содержит клетки инкубировали в 0,9% хлорида натрия в одиночку. Второй образец содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl 2. Пример 3 и 4 содержат клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl 2 или с 5 мкМ Са 2 +-канала агониста, (S )-(-)- Bay K8644, или 250 мкМ Са 2 +-канала антагонист, верапамил. Инкубируйте четырех образцов при температуре 37 ° по Цельсию с 5% CO 2 в течение 30 минут.
  5. Через 30 минут спином вниз клетки при 800 оборотов в минуту в течение 5 минут при 20 ° по Цельсию. Затем аспирата супернатант и мыть меченых клеток в два раза с PBS. После мытья, вновь приостановить каждая гранула 200 мкл PBS и передачи в пробирки ПЦР. Эти гранулы, как правило, белого цвета.

Железный Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток

  1. Смешайте клинико-класса протаминсульфат с дистиллированной водой, чтобы получить 1 мг / мл маточного раствора.
  2. В пробирку человеческих эмбриональных стволовых клеток медиа культуры, добавьте ferumoxides на уровне 100 мкг / мл с последующим добавлением 12 мкг / мл протамина сульфата. Смешайте раствор энергично в течение пяти минут.
  3. Добавить смешанные решения равное количество средств массовой информации клеточной культуры для достижения конечной концентрации 50 мкг / мл ferumoxides и 6 мкг / мл протамина сульфата на этикетке клеток. Инкубируйте клетки в этом растворе в течение 12 часов.
  4. Вымойте клетки дважды с PBS, с последним мыть содержащие гепарин 10U/ml распустить внеклеточной ferumoxides-протамина сульфат комплекса. После мытья trypsinize клетки для получения суспензии отдельных клеток.
  5. Граф клетки и аликвоты на необходимое количество образцов. После мытья, вновь приостановить каждая гранула 200 мкл PBS и передачи в пробирки ПЦР. Эти гранулы должны быть темно-оранжевого коричневого цвета.

Выполнение Сотовая Магнитно-резонансная томография

  1. Сделать фантом в целях стабилизации пробирки, содержащие ячейки гранул, а также, чтобы избежать артефактов из окружающего воздуха во время сканирования. Для этого смешайте 0,8% агара и 1% медного купороса в дистиллированной воде и довести его до кипения от микроволновой печи в течение 5-7 минут. Прохладный эта смесь, по крайней мере за 1 час до сканирования для достижения гель.
  2. Пробирки, содержащие гранулы помечены ячейки помещаются в фантом для сканирования. В пробирке сотовой МРТ проводится при Signa HDx 3Т МРТ (GE Medical Systems) с помощью клинических катушки колена.
  3. Сканирование марганца меченых клеток для каждого из трех образцов с помощью последовательности спинового эха: TR; Повторение времени = 800 мсек. TE; Эхо время = минимум, FOV; поле зрения = 12 х 12 см; матрица = 256x256, NEX 1.
  4. Сканирование железа меченых клеток, используя градиент-эхо последовательность. Мы используем следующие параметры для этого изображения: TR = 100 мсек, TE = 10 мсек, ФА; флип угол = 30 °; FOV = 12 х 12 см; матрица = 256 х 256, NEX 1.

Анализ результатов МРТ

  1. Анализ изображений МРТ с 4 различных образцов марганец-меченых клеток:
    • Пример № 1 нашего контроля, которая содержит клетки инкубировали в 0,9% хлорида натрия в одиночку.
    • Образец № 2 содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl 2.
    • Пример № 3 содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl 2 с 5 мкМ Са 2 +-канала агониста, (S )-(-)- Bay K8644.
    • Пример № 4 содержит клетки инкубировали в 0,1 ммоль MnCl 2 с 250 мкМ Са 2 +-канала антагонист, верапамил.
  2. Как и ожидалось, различия в интенсивности сигнала от марганца меченых клеток видны. По сравнению с клетками меченого чисто с марганцем, интенсивность сигнала заметно увеличивается в присутствии агониста кальциевых каналов и уменьшается в присутствии антагониста кальция канал. Области, где интенсивность сигнала возросла на марганец меченых клеток измеряются с помощью изображения J (NIH, Bethesda, MD, США). То же самое программное обеспечение используется для анализа области темных вне резонансного сигнала от железа меченых клеток. Размер темно сигнал от железа меченых клеток зависит от количества клеток или число частиц железа, содержащиеся клетками. В этом случае, Один миллион клеток показывает меньшую площадь темного сигнала по сравнению с сигналом от трех миллионов клеток.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Эти результаты показывают, что марганец делает войти через напряжения закрытого кальциевых каналов, и марганца может быть использован как МРТ контрастное вещество, которое может также показать жизнеспособность клеток. Таким образом, мы предполагаем, что марганец наведением МРТ может быть полезно для контроля жизнеспособности клеток после трансплантации человеческих эмбриональных стволовых клеток в миокард.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Type Company Catalog Number Comments
Manganese chloride tetrahydrate Reagent Sigma-Aldrich M8054
(S)-(-)-Bay K8644 Reagent Sigma-Aldrich B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration Reagent Sigma-Aldrich V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V Reagent VWR international VW 3257-1
Feridex I.V. Reagent Berlex Laboratories NDC 59338-7035-5 ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate Reagent American Pharmaceutical Partners NDC 63323-229-05 50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells) Reagent GIBCO, by Life Technologies 10828
DMEM/F12 (1:1) Reagent GIBCO, by Life Technologies 11330
2- mercapt–thanol 98+% Reagent Sigma-Aldrich M 3148
L-Glutamine 200mM 100x Reagent GIBCO, by Life Technologies 25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml Reagent GIBCO, by Life Technologies 15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution Reagent GIBCO, by Life Technologies 11140
Signa HDx 3T MRI Tool GE Healthcare
clinical Knee coil Tool GE Healthcare
DPBS Reagent GIBCO, by Life Technologies 14190

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts. Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).
  2. Aoki, I., et al. Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride. NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).
  3. Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
  4. Arbab, A. S., Frank, J. A. Cellular MRI and its role in stem cell therapy. Regen Med. 3, 199-215 (2008).
В пробирке Маркировка человеческих эмбриональных стволовых клеток для магнитно-резонансная томография
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yamada, M., Yang, P. In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (18), e827, doi:10.3791/827 (2008).More

Yamada, M., Yang, P. In vitro Labeling of Human Embryonic Stem Cells for Magnetic Resonance Imaging. J. Vis. Exp. (18), e827, doi:10.3791/827 (2008).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter