Summary
In deze video laten we zien hoe de menselijke embryonale stamcellen (hESC) met mangaan chloride (MnCl label
Abstract
Menselijke embryonale stamcellen (hESC) hebben aangetoond over het vermogen om de gewonde myocard te herstellen. Magnetic resonance imaging (MRI) heeft ontpopt als een van de belangrijkste beeldvormende modaliteiten aan het herstel van de geblesseerde myocard te beoordelen. Verder zijn ex-vivo labeling middelen, zoals ijzer-oxide nanodeeltjes, in dienst op te sporen en te lokaliseren de getransplanteerde stamcellen. Echter, deze methode niet volgen van een fundamentele celbiologie eigendom met betrekking tot de levensvatbaarheid van de getransplanteerde cellen. Het is bekend dat mangaan chloride (MnCl 2) van de cellen via de voltage-gated calcium (Ca 2 +) kanalen wanneer de cellen zijn biologisch actief binnenkomt, en accumuleert intracellulair voor het genereren van T een verkorting effect. Daarom stellen wij voor dat mangaan-geleide MRI kan nuttig zijn om levensvatbaarheid van de cellen te controleren na de transplantatie van hESC in het myocard.
In deze video laten we zien hoe de hESC label met MnCl 2 en hoe deze cellen is duidelijk te zien door gebruik te maken MRI in vitro. Op hetzelfde moment, biologische activiteit van Ca 2 +-kanalen worden gemoduleerd gebruik te maken van zowel Ca 2 +-kanaals agonist en antagonist co-signaal veranderingen te evalueren.
Protocol
Mangaan Labeling van menselijke embryonale stamcellen
- Trypsinize de menselijke embryonale stengels die zijn gekweekt in feeder-vrije omstandigheden gedurende 5 minuten. Neutraliseer de trypsine door het toevoegen van cultuur media.
- Spin down de cellen door centrifugeren bij 800 rpm gedurende 5 minuten bij 20 ° Celsius. Na opnieuw de opschorting van de celpellet, tel het aantal cellen door trypan blauwe vlekken. Op basis van de verkregen cellen, delen de cellen in vier porties van 3 miljoen cellen in conische buizen. Pellet de cellen weer door centrifugeren.
- Net voor het starten van de mangaan etikettering, de ontbinding van verse mangaanchloride met 0,9% natriumchloride-oplossing voor een 0.1mm mangaanchloride oplossing te maken.
- Om de calcium-kanaal-activiteit te observeren, werden vier monsters voorbereid. Het eerste monster is onze bepalen welke cellen geïncubeerd in 0,9% natriumchloride alleen bevat. Het tweede monster bevat cellen geïncubeerd in 0,1 mM MnCl 2. Voorbeeld 3 en 4 bevatten cellen geïncubeerd in 0,1 mM MnCl 2 met ofwel 5 pM van het Ca 2 +-kanaals agonist, (s )-(-)- Bay K8644, of 250 pM van het Ca 2 +-kanaal antagonist, verapamil. Incubeer de vier monsters bij 37 ° Celsius met 5% CO 2 gedurende 30 minuten.
- Na 30 minuten, spin down de cellen op 800 rpm gedurende 5 minuten bij 20 ° Celsius. Dan het supernatans aspireren en twee keer was de gelabelde cellen met PBS. Na het wassen, opnieuw te schorsen elk pellet met 200 pi PBS en de overdracht naar PCR-buizen. Deze pellets zijn meestal wit.
Ijzeren Labeling van menselijke embryonale stamcellen
- Mix klinisch-grade protaminesulfaat met gedestilleerd water tot een 1 mg / ml stockoplossing te krijgen.
- In een buis met menselijke embryonale stamcellen cultuur media, toe te voegen ferumoxides op 100 ug / ml gevolgd door toevoeging van 12 microgram / ml protamine sulfaat. Krachtig Meng de oplossing voor vijf minuten.
- Voeg gemengde oplossing om de gelijke hoeveelheid van de celkweek media tot een uiteindelijke concentratie van 50 ug / ml ferumoxides en 6 ug / ml van de protamine sulfaat te labelen cellen te bereiken. Incubeer de cellen in deze oplossing voor 12 uur.
- Twee keer wassen van de cellen met PBS, de laatste was met 10U/ml heparine aan de extracellulaire ferumoxides-protaminesulfaat complex te ontbinden. Na het wassen, trypsinize cellen tot een enkele cel suspensie te verkrijgen.
- Tel het aantal cellen en hoeveelheid in het vereiste aantal monsters. Na het wassen, opnieuw te schorsen elk pellet met 200 pi PBS en de overdracht naar PCR-buizen. Deze pellets moet donker oranje bruin van kleur.
Het uitvoeren van Cellular Magnetic Resonance Imaging
- Maak een fantoom om de buizen die de cel pellets te stabiliseren en ook om voorwerpen uit de omringende lucht te vermijden tijdens het scannen. Om dit te doen, mix 0,8% van de agar en 1% van kopersulfaat in gedestilleerd water en breng het aan de kook met de magnetron 5-7 minuten. Cool dit mengsel gedurende tenminste 1 uur voor van het scannen naar een gel te bereiken.
- De buizen met daarin de gelabelde cel pellets worden geplaatst in het fantoom voor het scannen. In vitro cellulaire MRI wordt uitgevoerd bij Signa HDX 3T MRI (GE Medical Systems) met behulp van de klinische knie spoel.
- Scan de mangaan gelabelde cellen voor elk van de drie monsters met behulp van een spin-echo sequentie: TR; Herhaling tijd = 800 msec. TE; Echo tijd = minimum, FOV, gezichtsveld = 12 x 12 cm; matrix = 256x256, NEX 1.
- Scan de ijzeren gemerkte cellen met behulp van een gradiënt-echo sequentie. We gebruiken de volgende parameters voor deze beeldvorming: TR = 100 msec; TE = 10 msec, FA, flip hoek = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; matrix = 256 x 256, NEX 1.
Het analyseren van de MRI-resultaten
- Analyseren van beelden van de MRI-scan uit 4 verschillende monsters van mangaan-gemerkte cellen:
- Sample # 1 is onze controle welke cellen geïncubeerd in 0,9% natriumchloride alleen bevat.
- Voorbeeld # 2 bevat cellen geïncubeerd in 0,1 mM MnCl 2.
- Sample # 3 bevat cellen geïncubeerd in 0,1 mM MnCl 2 met 5 uM van de Ca 2 +-kanaals agonist, (s )-(-)- Bay K8644.
- Sample # 4 bevat cellen geïncubeerd in 0,1 mM MnCl 2 met 250 pM van het Ca 2 +-kanaal antagonist, verapamil.
- Zoals voorspeld, de verschillen in signaal intensiteit van mangaan gelabelde cellen zichtbaar zijn. In vergelijking met de cellen puur gelabeld met mangaan, de signaal intensiteit verhoogt duidelijk in de aanwezigheid van de calcium-kanaal agonist en dalingen in de aanwezigheid van calcium kanaal antagonist. Het gebied waar de intensiteit van het signaal is toegenomen voor mangaan gelabelde cellen worden gemeten door gebruik te maken Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Dezelfde software wordt gebruikt voor het analyseren van het gebied van donkere off-resonantie-signaal van ijzer gelabelde cellen. De grootte van de donkere signaal van de ijzer-gelabelde cellen is afhankelijk van het aantal cellen of het aantal van de ijzerdeeltjes opgenomen door cellen. In dit geval, Een miljoen cellen geeft een kleiner gebied van donkere signaal in vergelijking met het signaal van de drie miljoen cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Deze resultaten geven aan dat mangaan heeft betreden via de voltage-gated calcium kanalen, en mangaan kan worden gebruikt als MRI contrastmiddel, dat ook kunnen laten zien van de levensvatbaarheid van de cellen. Daarom stellen wij voor dat mangaan-geleide MRI kan nuttig zijn om levensvatbaarheid van de cellen te controleren na de transplantatie van menselijke embryonale stamcellen in de hartspier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Manganese chloride tetrahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| (S)-(-)-Bay K8644 | Reagent | Sigma-Aldrich | B133 | |
| (+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration | Reagent | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V | Reagent | VWR international | VW 3257-1 | |
| Feridex I.V. | Reagent | Berlex Laboratories | NDC 59338-7035-5 | ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL |
| Protamine sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners | NDC 63323-229-05 | 50 mg (10 mg/mL) |
| Knockout SR (Serum replacement for ES cells) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | |
| DMEM/F12 (1:1) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | |
| 2- mercapt–thanol 98+% | Reagent | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Signa HDx 3T MRI | Tool | GE Healthcare | ||
| clinical Knee coil | Tool | GE Healthcare | ||
| DPBS | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190 |
References
- Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts. Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).
- Aoki, I., et al. Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride. NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Arbab, A. S., Frank, J. A. Cellular MRI and its role in stem cell therapy. Regen Med. 3, 199-215 (2008).
