Summary
I denna video visar vi hur etiketten mänskliga embryonala stamceller (hESC) med manganklorid (MnCl
Abstract
Mänskliga embryonala stamceller (hESC) ha visat förmåga att återställa den skadade hjärtmuskeln. Magnetisk resonanstomografi (MRT) har utvecklats till en av de dominerande avbildningsmetoder för att bedöma återställandet av den skadade hjärtmuskeln. Dessutom har ex vivo märkning medel, såsom järn-oxid nanopartiklar, använts för att spåra och lokalisera de transplanterade stamcellerna. Däremot övervakar denna metod inte en grundläggande cellbiologi egendom avseende lönsamheten hos transplanterade cellerna. Det har varit känt att manganklorid (MnCl 2) kommer in i cellerna via spänningskänsliga kalcium (Ca 2 +) kanaler när cellerna är biologiskt aktiva, och ackumuleras intracellulärt att generera T 1 kortare effekt. Därför föreslår vi att mangan-styrda MRT kan vara bra att kontrollera cellviabiliteten efter transplantation av hESC i hjärtmuskeln.
I denna video visar vi hur etiketten hESC med MnCl 2 och hur dessa celler kan tydligt ses genom att använda MRT in vitro. Samtidigt, biologisk aktivitet av Ca2 +-kanaler kommer att moduleras använda både Ca2 +-kanaler agonist och antagonist att utvärdera samtidig signal förändringar.
Protocol
Mangan Märkning av mänskliga embryonala stamcellslinjer
- Trypsinize den mänskliga embryonala stammar som har odlas i feeder-fri villkor i 5 minuter. Neutralisera trypsin genom att lägga till kulturen medier.
- Snurra ned cellerna genom att centrifugera vid 800 rpm i 5 minuter vid 20 ° Celsius. Efter att åter avbryta cellpelleten, räkna antalet celler genom trypan blå färgning. Baserat på cellen fått räkna, dela upp cellerna i fyra portioner på 3 miljoner celler i koniska rör. Pellets cellerna igen genom centrifugering.
- Strax innan mangan märkning, lös färska manganklorid med 0,9% natriumkloridlösning för att göra en 0.1mm manganklorid lösning.
- För att observera verksamheten kalciumantagonister har fyra prov som har beretts. Det första provet är vår kontroll, som innehåller celler inkuberas i 0,9% natriumklorid ensam. Det andra provet innehåller celler inkuberas i 0,1 mM MnCl 2. Prov 3 och 4 innehåller celler inkuberas i 0,1 mM MnCl 2 med antingen 5 mikroM av Ca2 +-kanaler agonist, (S )-(-)- Bay K8644, eller 250 mikroM av Ca2 +-kanaler antagonist, verapamil. Inkubera fyra prover vid 37 ° Celsius med 5% CO 2 i 30 minuter.
- Efter 30 minuter spinn ner cellerna vid 800 rpm i 5 minuter vid 20 ° Celsius. Sedan Aspirera supernatanten och tvätta den märkta cellerna två gånger med PBS. Efter tvätt, återsuspendera varje pellet med 200 mikroliter PBS och överför till PCR-rör. Dessa pellets är oftast vita.
Järn Märkning av mänskliga embryonala stamcellslinjer
- Blanda klinisk kvalitet protaminsulfat med destillerat vatten för att få en 1 mg / ml stamlösning.
- I ett rör med stamceller från mänskliga embryon media cellodling, lägg ferumoxides vid 100 mikrogram / ml följt av tillägg av 12 mikrogram / ml protaminsulfat. Blanda lösningen kraftigt i fem minuter.
- Lägg blandade lösningen till lika mycket av media cellodling för att nå en slutlig koncentration på 50 mikrogram / ml ferumoxides och 6 mikrog / ml protaminsulfat att märka celler. Inkubera cellerna i denna lösning i 12 timmar.
- Tvätta cellerna två gånger med PBS, med den sista tvättningen innehåller 10U/ml heparin för att lösa upp den extracellulära ferumoxides-protaminsulfat komplex. Efter tvätt, trypsinize celler för att få en enda cell suspension.
- Räkna celler och alikvoten in erforderligt antal prover. Efter tvätt, återsuspendera varje pellet med 200 mikroliter PBS och överför till PCR-rör. Dessa pellets ska vara mörkt orange brun i färgen.
Utföra Cellular Magnetic Resonance Imaging
- Gör en fantom för att stabilisera rören innehåller cellen pellets och även för att undvika artefakter från den omgivande luften under skanning. För att göra det, blanda 0,8% av agar och 1% koppar sulfat i destillerat vatten och ta med den till en koka i mikrovågsugnen i 5-7 minuter. Cool denna blandning i minst 1 timme före av scanning för att uppnå en gel.
- Rören innehåller märkt cellen pellets placeras i fantom för skanning. In vitro cellulära MRT utförs vid Signa HDX 3T MR (GE Medical Systems) genom klinisk knä spole.
- Skanna mangan märkta celler för vardera av de tre proven med hjälp av en sekvens spin eko: TR; Repetition tid = 800 msek. TE, Echo tid = minimum, FOV, synfält = 12 x 12 cm, matris = 256x256, NEX 1.
- Scan järnet märkta celler genom att använda en gradient-eko sekvens. Vi använder följande parametrar för denna avbildning: TR = 100 ms, TE = 10 ms, FA, flip vinkel = 30 °, FOV = 12 x 12 cm, matris = 256 x 256, NEX 1.
Analysera MR Resultat
- Analysera bilder av MRI-skanning från 4 olika prover av mangan-märkta celler:
- Prov # 1 är vår kontroll, som innehåller celler inkuberas i 0,9% natriumklorid ensam.
- Exempel # 2 innehåller celler inkuberas i 0,1 mM MnCl 2.
- Exempel # 3 innehåller celler inkuberas i 0,1 mM MnCl 2 med 5 mikroM av Ca2 +-kanaler agonist (s )-(-)- Bay K8644.
- Exempel # 4 innehåller celler inkuberas i 0,1 mM MnCl 2 med 250 mikroM av Ca2 +-kanaler antagonist, verapamil.
- Som förväntat, skillnader i signaler intensiteter från mangan märkta celler är synliga. Jämfört med cellerna märkta rent med mangan ökar signalstyrkan tydligt i närvaro av kalciumflödeshämmaren agonist och minskar i närvaro av kalcium antagonist. Området där signalstyrka har ökat för mangan märkta celler mäts med hjälp av Image J (NIH, Bethesda, MD, USA). Samma mjukvara används för att analysera området mörka off-resonans signal från järn-märkta celler. Storleken på mörka signaler från järn-märkta celler beror på antalet celler eller antalet järnpartiklar som finns av celler. I det här fallet, Visar en miljon celler ett mindre område för mörka signaler jämfört med signalen från de tre miljoner celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dessa resultat tyder på att mangan kommer in via spänningsstyrda kalciumantagonister, och mangan kan användas som MRT kontrastmedel, som också kan visa cellviabiliteten. Därför föreslår vi att mangan-styrda MRT kan vara bra att kontrollera cellviabiliteten efter transplantation av mänskliga embryonala stamceller i hjärtmuskeln.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Manganese chloride tetrahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| (S)-(-)-Bay K8644 | Reagent | Sigma-Aldrich | B133 | |
| (+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration | Reagent | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V | Reagent | VWR international | VW 3257-1 | |
| Feridex I.V. | Reagent | Berlex Laboratories | NDC 59338-7035-5 | ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL |
| Protamine sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners | NDC 63323-229-05 | 50 mg (10 mg/mL) |
| Knockout SR (Serum replacement for ES cells) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | |
| DMEM/F12 (1:1) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | |
| 2- mercapt–thanol 98+% | Reagent | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Signa HDx 3T MRI | Tool | GE Healthcare | ||
| clinical Knee coil | Tool | GE Healthcare | ||
| DPBS | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190 |
References
- Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts. Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).
- Aoki, I., et al. Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride. NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Arbab, A. S., Frank, J. A. Cellular MRI and its role in stem cell therapy. Regen Med. 3, 199-215 (2008).
