Summary
इस वीडियो में, हम दिखा रहे हैं कैसे मैंगनीज क्लोराइड के साथ मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) (MnCl लेबल
Abstract
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESC) घायल मायोकार्डियम बहाल करने की क्षमता का प्रदर्शन किया है. चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के एक प्रमुख इमेजिंग रूपात्मकता के रूप में उभरा है घायल मायोकार्डियम की बहाली का आकलन. इसके अलावा, पूर्व vivo लेबलिंग एजेंट, जैसे लोहे के आक्साइड नैनोकणों ट्रैक करने के लिए नियोजित किया गया है और प्रतिरोपित स्टेम कोशिकाओं स्थानीयकरण. हालांकि, इस पद्धति एक मौलिक सेलुलर जीव विज्ञान प्रतिरोपित कोशिकाओं की व्यवहार्यता के बारे में संपत्ति की निगरानी नहीं करता है. यह ज्ञात किया गया है कि मैंगनीज क्लोराइड (2 MnCl) वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल (सीए + 2) जब कोशिकाओं biologically सक्रिय कर रहे हैं के माध्यम से कोशिकाओं में प्रवेश करती है, और intracellularly जम टी 1 छोटा प्रभाव उत्पन्न है. इसलिए, हम बताते हैं कि एमआरआई मैंगनीज निर्देशित मायोकार्डियम में hESC के प्रत्यारोपण के बाद सेल व्यवहार्यता की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकता है.
इस वीडियो में, हम दिखा देंगे कि कैसे 2 MnCl और कैसे उन कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से इन विट्रो में एमआरआई का उपयोग करके देखा जा सकता है है के साथ hESC लेबल करने के लिए. एक ही समय में, 2 Ca की जैविक गतिविधि + चैनलों modulated किया जा दोनों agonist 2 + चैनल Ca और विरोधी का उपयोग करने के लिए सहवर्ती संकेत परिवर्तन का मूल्यांकन होगा .
Protocol
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की मैंगनीज लेबल
- Trypsinize मानव भ्रूण उपजी है, जो फीडर मुफ्त 5 मिनट के लिए शर्तों में संवर्धित किया गया है. संस्कृति मीडिया जोड़कर trypsin बेअसर.
- नीचे 5 मिनट के लिए 800 rpm पर 20 centrifuging द्वारा कोशिकाओं स्पिन ° सेल्सियस. फिर निलंबित सेल गोली के बाद, trypan नीले रंग धुंधला हो जाना द्वारा कोशिकाओं की संख्या गिनती. सेल प्राप्त की गिनती के आधार पर, शंक्वाकार ट्यूबों में 3 मिलियन कोशिकाओं के चार aliquots में कोशिकाओं को विभाजित. गोली centrifugation द्वारा फिर से कोशिकाओं.
- मैंगनीज लेबलिंग शुरू करने से पहले बस, 0.9% सोडियम क्लोराइड समाधान के लिए एक 0.1mm मैंगनीज क्लोराइड समाधान बनाने के साथ नए सिरे से मैंगनीज क्लोराइड भंग.
- आदेश में कैल्शियम चैनल गतिविधि का निरीक्षण करने के लिए, चार नमूने तैयार थे. पहला नमूना हमारे नियंत्रण है जो 0.9% सोडियम क्लोराइड अकेले में incubated कोशिकाओं शामिल है. दूसरे नमूने में 0.1 मिमी MnCl 2 में incubated कोशिकाओं हैं . नमूना 3 और 4 2 agonist Ca + चैनल के या तो 5 सुक्ष्ममापी के साथ 0.1 मिमी 2 MnCl में incubated कोशिकाओं (ओं )-(-)- K8644, बे, या 2 + चैनल प्रतिपक्षी Ca, verapamil के 250 सुक्ष्ममापी होते हैं . 37 में चार नमूने 30 मिनट के लिए 5% सीओ 2 के साथ सेते ° सेल्सियस .
- 30 मिनट के बाद, नीचे 20 ° सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 800 rpm पर कोशिकाओं स्पिन. फिर सतह पर तैरनेवाला aspirate और लेबल कोशिकाओं पीबीएस के साथ दो बार धोने. धोने के बाद, पीसीआर नलियों में 200 μL पीबीएस और हस्तांतरण के साथ प्रत्येक गोली फिर से निलंबित. इन छर्रों आम तौर पर सफेद हैं.
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की आयरन लेबल
- आसुत जल के साथ मिश्रण नैदानिक ग्रेड protamine सल्फेट एक 1 मिलीग्राम / एमएल शेयर समाधान पाने के लिए.
- एक ट्यूब में मानव भ्रूण स्टेम सेल संस्कृति मीडिया वाले, 100 μg / एमएल ferumoxides 12 μg / एमएल protamine सल्फेट के अलावा के बाद जोड़ें. पांच मिनट के लिए समाधान सख्ती मिक्स.
- सेल संस्कृति मीडिया के बराबर राशि के लिए मिश्रित समाधान 50 / μg ferumoxides के एमएल और 6 μg / लेबल कोशिकाओं को protamine सल्फेट के एमएल के एक अंतिम एकाग्रता को प्राप्त करने में जोड़ें. 12 घंटे के लिए इस समाधान में कोशिकाओं को सेते हैं.
- कोशिकाओं को दो बार पीबीएस के साथ पिछले 10U/ml हेपरिन युक्त कोशिकी सल्फेट ferumoxides - protamine जटिल भंग धोने के साथ धो. धोने के बाद, कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक एकल कक्ष निलंबन trypsinize.
- नमूनों की अपेक्षित संख्या में कोशिकाओं और विभाज्य गणना. धोने के बाद, पीसीआर नलियों में 200 μL पीबीएस और हस्तांतरण के साथ प्रत्येक गोली फिर से निलंबित. इन छर्रों अंधेरे नारंगी भूरे रंग के रंग में होना चाहिए.
सेलुलर चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग प्रदर्शन
- एक प्रेत के क्रम में सेल छर्रों युक्त ट्यूबों को स्थिर करने के लिए और भी स्कैनिंग के दौरान आसपास के हवा से कलाकृतियों से बचने. ऐसा करने के लिए, आसुत जल में अगर की 0.8% और 1% तांबा सल्फेट के मिश्रण और एक फोड़ा करने के लिए इसे 5-7 मिनट के लिए microwaving द्वारा लाने. इस मिश्रण को कम से कम 1 घंटे के लिए एक जेल प्राप्त की स्कैनिंग की पूर्व के लिए अच्छा है.
- लेबल सेल छर्रों युक्त ट्यूबों प्रेत में स्कैनिंग के लिए रखा जाता है. इन विट्रो सेलुलर एमआरआई में Signa HDX 3T एमआरआई (जीई मेडिकल सिस्टम्स) में नैदानिक घुटने का तार का उपयोग करके किया जाता है.
- तीन नमूने का उपयोग कर एक स्पिन गूंज अनुक्रम में से प्रत्येक के लिए मैंगनीज लेबल कोशिकाओं को स्कैन: टी.आर., दोहराव समय = 800 मिसे. ते, इको समय = न्यूनतम, FOV, देखने के क्षेत्र = 12 x 12 सेमी, = मैट्रिक्स 256x256, नेक्स 1.
- लोहे लेबल कोशिकाओं ढाल गूंज एक अनुक्रम का उपयोग करके स्कैन करें. हम इस इमेजिंग के लिए निम्न पैरामीटर का उपयोग: टी.आर. = 100 मिसे, ते = 10 मिसे, एफए, फ्लिप कोण = 30 °, FOV = 12 x 12 सेमी, = मैट्रिक्स 256 256 x, 1 नेक्स.
एमआरआई परिणाम का विश्लेषण
- मैंगनीज लेबल की कोशिकाओं के 4 विभिन्न नमूनों से एमआरआई स्कैन की छवियों का विश्लेषण:
- # 1 नमूना हमारे नियंत्रण है जो 0.9% सोडियम क्लोराइड अकेले में incubated कोशिकाओं शामिल है.
- # 2 नमूना 0.1 मिमी 2 MnCl में incubated कोशिकाओं में शामिल है.
- # 3 नमूना 2 agonist Ca + चैनल के 5 सुक्ष्ममापी (ओं )-(-)- K8644 बे के साथ 0.1 मिमी 2 MnCl में incubated कोशिकाओं में शामिल है.
- # 4 नमूना 2 + चैनल प्रतिपक्षी Ca, verapamil 250 सुक्ष्ममापी के साथ 0.1 मिमी 2 MnCl में incubated कोशिकाओं में शामिल है.
- के रूप में भविष्यवाणी की है, संकेत तीव्रता में मैंगनीज लेबल कोशिकाओं से मतभेद दिखाई दे रहे हैं. मैंगनीज के साथ विशुद्ध रूप से लेबल की कोशिकाओं की तुलना में, संकेत तीव्रता स्पष्ट रूप से कैल्शियम चैनल agonist की उपस्थिति में बढ़ जाती है और कैल्शियम चैनल प्रतिपक्षी की उपस्थिति में घट जाती है. क्षेत्र है जहां संकेत तीव्रता मैंगनीज लेबल कोशिकाओं के लिए बढ़ गया है छवि जम्मू (NIH, Bethesda, एमडी, संयुक्त राज्य अमेरिका) का उपयोग करके मापा जाता है. एक ही सॉफ्टवेयर लोहा लेबल कोशिकाओं से अंधेरे बंद अनुनाद संकेत के क्षेत्र का विश्लेषण करने के लिए प्रयोग किया जाता है. लोहे लेबल कोशिकाओं से अंधेरे संकेत के आकार कक्षों या लोहे की कोशिकाओं द्वारा निहित कणों की संख्या की संख्या पर निर्भर करता है. इस मामले मेंएक मिलियन कोशिकाओं अंधेरे संकेत के एक छोटे तीन मिलियन कोशिकाओं से संकेत की तुलना में क्षेत्र से पता चलता है.
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Discussion
इन परिणामों से संकेत मिलता है कि मैंगनीज वोल्टेज gated कैल्शियम चैनल, और मैंगनीज एमआरआई इसके विपरीत एजेंट के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, जो भी सेल व्यवहार्यता दिखा सकते हैं के माध्यम से प्रवेश करता है. इसलिए, हम बताते हैं कि एमआरआई मैंगनीज निर्देशित मायोकार्डियम में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के प्रत्यारोपण के बाद सेल व्यवहार्यता की निगरानी के लिए उपयोगी हो सकता है.
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Manganese chloride tetrahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| (S)-(-)-Bay K8644 | Reagent | Sigma-Aldrich | B133 | |
| (+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration | Reagent | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V | Reagent | VWR international | VW 3257-1 | |
| Feridex I.V. | Reagent | Berlex Laboratories | NDC 59338-7035-5 | ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL |
| Protamine sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners | NDC 63323-229-05 | 50 mg (10 mg/mL) |
| Knockout SR (Serum replacement for ES cells) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | |
| DMEM/F12 (1:1) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | |
| 2- mercapt–thanol 98+% | Reagent | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Signa HDx 3T MRI | Tool | GE Healthcare | ||
| clinical Knee coil | Tool | GE Healthcare | ||
| DPBS | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190 |
References
- Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts. Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).
- Aoki, I., et al. Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride. NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Arbab, A. S., Frank, J. A. Cellular MRI and its role in stem cell therapy. Regen Med. 3, 199-215 (2008).
