Summary
このビデオでは、我々は、塩化マンガンを持つヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）（MnClラベルの作成方法を示しています
Abstract
ヒト胚性幹細胞（ヒトES細胞）負傷した心筋を復元する能力を実証している。磁気共鳴イメージング（MRI）は、負傷した心筋の回復を評価するための主な画像診断法の一つとして浮上している。さらに、このような酸化鉄ナノ粒子などの生体外の標識剤は、追跡するために採用し、移植された幹細胞をローカライズされています。しかし、この方法は、移植細胞の生存率に関する基本的な細胞生物学のプロパティを監視しません。それは、塩化マンガン（MnCl 2を ） は電位依存性カルシウム（Ca 2 +）細胞は生物学的に活性であるチャネルを介して細胞に入ると、T 1短縮の効果を生成する細胞内で蓄積することが知られている。したがって、我々はマンガン誘導MRIは心筋へのhESCの移植後の細胞生存率を監視するために有用であることを示唆している。
このビデオでは、我々は、MnCl 2を 、どのようにそれらの細胞は明らかにin vitroでMRIを用いて見ることができるとヒトES細胞をラベルする方法が表示されます。それと同時に、 カルシウムの生物活性は、+ -チャネル併用信号の変化を評価するためのCa 2 +チャネルのアゴニストおよびアンタゴニストの両方を利用して変調されます。
Protocol
ヒト胚性幹細胞のマンガン標識
- フィーダーフリーで5分間の条件で培養されたヒト胚性の茎をトリプシン処理。培地を加えることによってトリプシンを中和する。
- 20℃で5分間800rpmで遠心分離によって細胞をスピンダウン摂氏。細胞ペレットを再懸濁させた後、トリパンブルー染色により細胞数をカウント。得られた細胞の数に基づいて、コニカルチューブに3万個の細胞の4つのアリコートにセルを分割します。遠心分離によって再び細胞をペレット化。
- 単にマンガンラベリングを開始する前に、0.1mmの塩化マンガン溶液を作るために0.9％塩化ナトリウム溶液で新鮮な塩化マンガンを溶解する。
- カルシウムチャネル活性を観察するために、4つのサンプルを調製した。最初のサンプルは、単独で0.9％塩化ナトリウムでインキュベートした細胞を含む私たちのコントロールです。 2番目のサンプルは、0.1mMのMnCl 2をでインキュベートした細胞が含まれています。サンプル3と4は、Ca 2 +チャネルアゴニストの5μMのいずれかと0.1mMのMnCl 2をでインキュベートした細胞、（S )-(-)-ベイK8644、またはCa 2 +チャネル拮抗薬、ベラパミルの250μMが含まれています。 37 4つのサンプルをインキュベート℃で30分間、5％CO 2で摂氏。
- 30分後、20℃摂氏で5分間800rpmで細胞をスピンダウン。その後、上清を吸引し、PBSで2回標識された細胞を洗う。洗浄後、PCRチューブに200μLのPBSと転送で各ペレットを再懸濁する。これらのペレットは、通常は白です。
ヒト胚性幹細胞の鉄ラベリング
- 1 mg / mLの原液を得るために蒸留水で臨床グレードの硫酸プロタミンを混ぜる。
- ヒト胚性幹細胞の培養培地を含むチューブに、12μg/ mLの硫酸プロタミンを加えて100μg/ mlの時ferumoxidesを追加します。 5分間激しくソリューションを混ぜる。
- ferumoxides 50μg/ mLのとラベルの細胞にプロタミン硫酸塩の6μg/ mLの最終濃度を達成するために細胞培養培地を等量に混合溶液を追加。 12時間このソリューションで細胞をインキュベートする。
- 細胞外ferumoxides -硫酸プロタミン複合体を溶解する10U/mlヘパリンを含む最後の洗浄を、PBSで細胞を2回洗浄する。洗浄後、単一の細胞懸濁液を得るために細胞をトリプシン処理。
- サンプルの必要数に細胞やアリコートを数える。洗浄後、PCRチューブに200μLのPBSと転送で各ペレットを再懸濁する。これらのペレットは色の濃いオレンジブラウンにする必要があります。
携帯磁気共鳴イメージングの実行
- 細胞ペレットを含むチューブを安定させるために、また、スキャン中に周囲の空気からのアーチファクトを避けるために、ファントムを行います。そのためには、蒸留水に寒天0.8％と硫酸銅の1％を混ぜると5-7分のために電子レンジで沸騰することをもたらす。ゲルを達成するためにスキャンの前に少なくとも1時間この混合物を冷却する。
- 標識細胞ペレットを含むチューブは、スキャン用ファントムに配置されます。試験管内の細胞MRIの臨床膝のコイルを使用してのSigna半二重（HDx）3T MRI（GEメディカルシステムズ）で行われます。
- スピンエコーシーケンスを使用して3つのサンプルのそれぞれに対してマンガン標識された細胞をスキャンする：TRを、繰り返し時間= 800ミリ秒。 TE、エコーの時間=最小、FOV、視野= 12 × 12センチメートル、マトリクス= 256 × 256、NEX 1。
- グラディエントエコーシーケンスを使用して鉄標識された細胞をスキャンします。我々は、このイメージングのための次のパラメータを使用します。TR = 100ミリ秒、TE = 10ミリ秒、FA、フリップ角= 30 °、FOV = 12 × 12センチメートル、マトリクス= 256 × 256、NEX 1。
MRI結果の解析
- マンガン標識細胞の4種類のサンプルからMRIスキャンの画像を分析する。
- サンプル＃1は、単独で0.9％塩化ナトリウムでインキュベートした細胞を含む私たちのコントロールです。
- サンプル＃2は、0.1mMのMnCl 2をでインキュベートした細胞が含まれています。
- サンプル＃3は、Ca 2 +チャネルアゴニストの5μM、（S )-(-)-ベイK8644と0.1mMのMnCl 2をでインキュベートした細胞が含まれています。
- サンプル＃4は、Ca 2 +チャネル拮抗薬、ベラパミルの250μMと0.1mMのMnCl 2をでインキュベートした細胞が含まれています。
- 予想通り、マンガン標識された細胞からの信号強度の違いが表示されています。マンガンと純粋に標識された細胞と比較して、信号強度は明らかにカルシウムチャネルのアゴニストの存在下で増加し、カルシウムチャンネル拮抗薬の存在下で減少する。信号強度は、マンガン標識された細胞のために増加している領域は、イメージJを（NIH、ベセスダ、MD、米国）を用いて測定されています。同ソフトウェアは、鉄標識された細胞から濃いオフ共鳴信号の領域を分析するために使用されます。鉄で標識された細胞からの暗信号の大きさは、細胞または細胞に含まれる鉄の粒子の数の数によって異なります。このケースで、100万セルは300万セルからの信号に比べて暗い信号の小さな領域を示しています。
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Discussion
これらの結果は、マンガンはまた、細胞の生存率を示すことができる電位依存性カルシウムチャネル、およびマンガンはMRI造影剤として使用することができる、を経由して入力していないことを示している。したがって、我々はマンガン誘導MRIは心筋にヒト胚性幹細胞の移植後の細胞生存率を監視するために有用であることを示唆している。
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Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Manganese chloride tetrahydrate | Reagent | Sigma-Aldrich | M8054 | |
| (S)-(-)-Bay K8644 | Reagent | Sigma-Aldrich | B133 | |
| (+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration | Reagent | Sigma-Aldrich | V4629 | |
| Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V | Reagent | VWR international | VW 3257-1 | |
| Feridex I.V. | Reagent | Berlex Laboratories | NDC 59338-7035-5 | ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL |
| Protamine sulfate | Reagent | American Pharmaceutical Partners | NDC 63323-229-05 | 50 mg (10 mg/mL) |
| Knockout SR (Serum replacement for ES cells) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828 | |
| DMEM/F12 (1:1) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330 | |
| 2- mercapt–thanol 98+% | Reagent | Sigma-Aldrich | M 3148 | |
| L-Glutamine 200mM 100x | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030 | |
| Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140 | |
| Signa HDx 3T MRI | Tool | GE Healthcare | ||
| clinical Knee coil | Tool | GE Healthcare | ||
| DPBS | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 14190 |
References
- Bruvold, M., Nordhoy, W., Anthonsen, H. W., Brurok, H., Jynge, P. Manganese-calcium interactions with contrast media for cardiac magnetic resonance imaging: a study of manganese chloride supplemented with calcium gluconate in isolated Guinea pig hearts. Invest Radiol. 40, 117-125 (2005).
- Aoki, I., et al. Cell labeling for magnetic resonance imaging with the T1 agent manganese chloride. NMR Biomed. 19, 50-59 (2006).
- Arbab, A. S., et al. Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI. Blood. 104, 1217-1223 (2004).
- Arbab, A. S., Frank, J. A. Cellular MRI and its role in stem cell therapy. Regen Med. 3, 199-215 (2008).
