Na rotulagem in vitro de células estaminais embrionárias humanas para Ressonância Magnética

Summary

Neste vídeo, estamos mostrando como rotular células estaminais embrionárias humanas (CTEh) com cloreto de manganês (MnCl

Abstract

Células estaminais embrionárias humanas (CTEh) demonstraram a capacidade de restaurar o miocárdio lesado. A ressonância magnética (MRI) emergiu como uma das modalidades de imagem predominante para avaliar a recuperação do miocárdio lesado. Além disso, os agentes ex-vivo rotulagem, tais como nanopartículas de óxido de ferro, têm sido empregados para rastrear e localizar as células-tronco transplantadas. No entanto, este método não monitora uma propriedade biologia celular fundamental em relação à viabilidade das células transplantadas. Tem sido conhecido que o cloreto de manganês (MnCl ₂₎ entra nas células através de voltagem dependentes de cálcio (Ca ^{2 +)} canais quando as células são biologicamente ativos, e acumula intracelularmente para gerar T efeito encurtamento ^1. Portanto, sugerimos que o manganês guiada ressonância magnética pode ser útil para monitorar a viabilidade das células após o transplante de CTEh no miocárdio.

Neste vídeo, vamos mostrar como rotular CTEh com MnCl ₂ e como essas células podem ser claramente vistos usando MRI in vitro. Ao mesmo tempo, a atividade biológica de Ca ^{2 +-channels} será modulada utilizando tanto Ca ^{2 +} canal-agonistas e antagonistas para avaliar as alterações do sinal concomitante.

Protocol

Rotulagem de manganês de células estaminais embrionárias humanas

1. Trypsinize as hastes embrionárias humanas que foram cultivadas no alimentador sem condições por 5 minutos. Neutralizar a tripsina, adicionando meios de cultura.
2. Girar as células por centrifugação a 800 rpm por 5 minutos a 20 ° Celsius. Após re-suspensão de células do sedimento, contar o número de células por trypan coloração azul. Com base na contagem de células obtidas, divide as células em quatro alíquotas de 3 milhões de células em tubos cônicos. Agregar as células novamente por centrifugação.
3. Pouco antes de iniciar a rotulagem de manganês, dissolver o cloreto de manganês fresco com solução 0,9% de cloreto de sódio para fazer uma solução de cloreto de 0,1 mM de manganês.
4. , A fim de observar a atividade dos canais de cálcio, quatro amostras foram preparadas. A primeira amostra é de nosso controle que contém células incubadas em cloreto de sódio 0,9% sozinho. A segunda amostra contém células incubadas em 0,1 mM MnCl _2. Amostra 3 e 4 contêm células incubadas em 0,1 mM MnCl ₂ com qualquer um dos 5 mM de Ca ^{2 +} canais agonista, (s )-(-)- Bay K8644, ou 250 mM de Ca ^{2 +} canais antagonista, verapamil. Incubar as quatro amostras a 37 ° Celsius com 5% de CO ₂ por 30 minutos.
5. Após 30 minutos, girar as células a 800 rpm por 5 minutos a 20 ° Celsius. Em seguida, aspire o sobrenadante e lavar a células marcadas duas vezes com PBS. Após a lavagem, re-suspender cada pellet com 200 mL de PBS e transferir para tubos de PCR. Essas pelotas são geralmente brancos.

Rotulagem de ferro de células estaminais embrionárias humanas

1. Mix clínico-grade sulfato de protamina com água destilada para obter uma solução estoque 1 mg / mL.
2. Em um tubo contendo-tronco embrionárias humanas meios de cultura de células, adicionar ferumoxides a 100 mcg / mL seguido pela adição de 12 mcg / mL sulfato de protamina. Misturar a solução vigorosamente por cinco minutos.
3. Adicionar solução mista para a mesma quantidade de meios de cultura celular para obter uma concentração final de 50 mcg / mL de ferumoxides e 6 mcg / ml do sulfato de protamina para as células rótulo. Incubar as células nessa solução por 12 horas.
4. Lave as células duas vezes com PBS, com a última lavagem contendo heparina 10U/ml de dissolver o complexo de sulfato extracelular ferumoxides-protamina. Após a lavagem, trypsinize células para obter uma suspensão única célula.
5. Contar as células e alíquotas para o número necessário de amostras. Após a lavagem, re-suspender cada pellet com 200 mL de PBS e transferir para tubos de PCR. Estas pelotas deve ser laranja escuro na cor marrom.

Realizar Ressonância Magnética Cellular

1. Faça um fantasma, a fim de estabilizar os tubos contendo os pellets celulares e também para evitar artefatos a partir do ar circundante durante a digitalização. Para isso, mistura 0,8% de ágar e 1% de sulfato de cobre em água destilada e trazê-la para ferver por microondas por 5-7 minutos. Legal essa mistura durante pelo menos 1 hora antes de digitalizar para atingir um gel.
2. Os tubos contendo os pellets celulares rotulados são colocados no fantasma para a digitalização. Celulares in vitro MRI é realizada em Signa HDX 3T MRI (GE Medical Systems), utilizando bobina de joelho clínico.
3. Varredura as células de manganês rotulados para cada uma das três amostras utilizando uma seqüência spin echo: TR, tempo de repetição = 800 ms. TE, tempo de eco = mínimo, FOV, campo de visão = 12 x 12 cm; matriz = 256x256, NEX 1.
4. Varredura as células de ferro rotulados usando uma seqüência gradiente-eco. Usamos os seguintes parâmetros para esta imagem: TR = 100 ms; TE = 10 ms, FA; ângulo de inclinação = 30 °; FOV = 12 x 12 cm; matriz = 256 x 256, NEX 1.

Analisando os resultados da RM

1. Analisar imagens de ressonância magnética de 4 diferentes amostras de células-manganês rotulados:
   • Amostra n º 1 é nosso controle que contém células incubadas em cloreto de sódio 0,9% sozinho.
   • Amostra # 2 contém células incubadas em 0,1 mM MnCl _2.
   • # 3 da amostra contém células incubadas em 0,1 mM MnCl ₂ com 5 mM de Ca ^{2 +} canal-agonista, (s )-(-)- Bay K8644.
   • Amostra # 4 contém células incubadas em 0,1 mM MnCl ₂ com 250 mM de Ca ^{2 +} canal-antagonista, verapamil.
2. Como previsto, as diferenças na intensidade do sinal de manganês células marcadas são visíveis. Em comparação com as células rotuladas puramente com o manganês, a intensidade do sinal claramente aumenta na presença do agonista dos canais de cálcio e diminui na presença de antagonista dos canais de cálcio. A área onde a intensidade do sinal aumentou de manganês células marcadas são medidos usando Image J (NIH, Bethesda, MD, EUA). O mesmo software é usado para analisar a área de sinal fora de ressonância escuro de ferro células marcadas. O tamanho do sinal escura do ferro-rotulados células depende do número de células ou o número de partículas de ferro contido pelas células. Neste caso, Um milhão de células mostra uma área menor sinal escura em comparação com o sinal a partir dos três milhões de células.

Discussion

Estes resultados indicam que o manganês não entra através do canal de cálcio voltagem-dependentes, e manganês pode ser usado como agente de contraste para IRM, que também pode mostrar a viabilidade celular. Portanto, sugerimos que o manganês guiada ressonância magnética pode ser útil para monitorar a viabilidade das células após o transplante de células estaminais embrionárias humanas no miocárdio.

Materials

Name	Type	Company	Catalog Number	Comments
Manganese chloride tetrahydrate	Reagent	Sigma-Aldrich	M8054
(S)-(-)-Bay K8644	Reagent	Sigma-Aldrich	B133
(+)-Verapamil hydrochloride, minimum 99.0% titration	Reagent	Sigma-Aldrich	V4629
Sodium Chloride 0.85-0.90% W/V	Reagent	VWR international	VW 3257-1
Feridex I.V.	Reagent	Berlex Laboratories	NDC 59338-7035-5	ferumoxides injectable solution 11.2mg iron/mL
Protamine sulfate	Reagent	American Pharmaceutical Partners	NDC 63323-229-05	50 mg (10 mg/mL)
Knockout SR (Serum replacement for ES cells)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	10828
DMEM/F12 (1:1)	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11330
2- mercapt–thanol 98+%	Reagent	Sigma-Aldrich	M 3148
L-Glutamine 200mM 100x	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	25030
Penicillin-Streptomyocin 10,000 units/ml	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
MEM Non-Essential Amino Acids 100x solution	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	11140
Signa HDx 3T MRI	Tool	GE Healthcare
clinical Knee coil	Tool	GE Healthcare
DPBS	Reagent	GIBCO, by Life Technologies	14190