Summary
Denna video visar hur att upprätthålla tillväxten av stamceller från mänskliga embryon (hESCs) i mataren cellfria villkor och hur man kontinuerligt passage hESCs i mataren cellfria förhållanden. Bekräftelse av hESC pluripotens odlas i mataren cellfria förhållanden genom immunofluorescens mikroskopi är också påvisas. Del 2 av 3.
Abstract
Denna video visar hur man odlar stamceller från mänskliga embryon (hESCs) på musens embryonala fibroblaster (MEF) feeder celler, hur man passage hESCs från MEF plattor till feeder cellfria Matrigel plattor.
Protocol
hESC kultur dagligt underhåll
- hESC odlingsmedia måste bytas var 24 timmar. Från ES media lager flaska förvaras vid 4 ° C, ta ut den mängd lösning som krävs (~ 20 ml per 6-brunnar) och placera i en 50ml falk rör, och värm till 37 ° C i ett vattenbad. När media är varm, lägg bFGF lagras vid 4 ° C till en slutlig koncentration av 10ng/ml. Sätt bFGF beståndet tillbaka vid 4 ° C omedelbart efter användning!
- Ta bort från 6-brunnars plattor alla utom ~ 500μl av media. Se till att snurra kulturen skålen att avbryta skräp för borttagning. Se till att bFGF i media hESC kultur blandas noga och tillsätt 3 ml av färsk media tillbaka till varje brunn i en 6-brunnar. Sätt plattan tillbaka i inkubatorn.
Delning hESCs från MEFs på Matrigel
Vanligtvis en sammanhängande 6-brunnar i hESCs på MEFs kan delas 1:02 till 01:03 på Matrigel 6-brunnars plattor, med brunnarna blir konfluenta igen 4-5 dagar efter klyvning.
- Vid delning hESCs på Matrigel, MEF-conditioned media (CM) används för att upprätthålla pluripotens. MEF-conditioned media görs i förväg. Den första dagen är 1,5 × 10 7 γ-bestrålade MEFs seedade i en T75 kolven. Den andra dagen är MEFs tvättas en gång med rumstemperatur 1 × PBS, pH 7,4 och sedan 15 ml av ES media kompletteras med 5ng/ml bFGF läggs till kolven. (OBS: MEFs kan beläggas i mindre eller större flaskor, men andelen mellan celltäthet och volymen av ES medier bör vara konstant.) Kolven är inkuberas vid 37 ° C i ytterligare 24 timmar. På den tredje dagen är CM samlas in och ersätts med 15 ml av färsk ES media kompletteras med 5ng/ml bFGF. De insamlade CM lagras vid 4 ° C. MEF-conditioned media från en plätering av MEFs skördas under sju dagar i följd för att generera 15 × 7 = 105ml. Efter sju dagar, är alla CM fraktioner kombination, steril filtreras, alikvoteras och förvaras vid -20 ° C. CM media har beretts enligt anvisningarna kan lagras och användas för 1 månad.
- En dag innan hESC delning, satte Matrigel alikvoter i Eppendorf rör vid 4 ° C för att tina över natten (en alikvot innehåller 76.2mg av Matrigel, och detta är det belopp som behövs för en 6-brunnar). På dagen för delning, ta en flaska av de upptinade Matrigel för en 6-brunnar, placera flaskan och 6 ml av kallt DMEM/F12 media på is. Överför Matrigel i DMEM/F12 media och blanda väl. Tillsätt 1 ml av lösningen till varje brunn i en 6-brunnar. Snurra plattan att distribuera Matrigel på ytan och inkubera Matrigel täckta plattan vid rumstemperatur i minst 1 timme innan du delar den hESCs.
- hESCs på MEFs tvättas en gång med 1 × PBS, pH 7,4. Därefter 1 ml varmt kollagenas IV (1mg/ml) läggs till varje brunn på 6-brunnar och plattan inkuberas vid 37 ° C i 5-10 min.
- Tillsätt 1 ml av ES media utan bFGF i varje brunn. Använd en 1 ml pipett att blåsa stamceller från plattan. Samla alla medier som innehåller klumpar av hESCs och döda MEFs till en 50 ml falk rör. Låt stora klumpar av celler nöja 5-10 min så att hESC klumpar bilda en pellet på botten av röret medan MEFs hålla sig svävande i supernatanten. Kassera supernatanten och tvätta av resuspending den hESC pellets med hjälp av ES-medier saknas bFGF, följt av centrifugering i rumstemperatur vid 200g i 5 min.
- Till tallrik stamcellerna på Matrigel tallrikar, först tvätta Matrigel plattorna med rumstemperatur DMEM/F12 (1 ml per brunn) och lägga till 2,5 ml av CM kompletteras med 10ng/ml bFGF per brunn. Återsuspendera pelleten i en lämplig volym av CM kompletteras med 10ng/ml bFGF, pipett cellsuspensionen upp och ned flera gånger tills klumpar blir enhetliga och mindre i storlek. Alikvotera suspensionen till 0,5 ml per brunn på Matrigel plattan. Observera att kolonin densitet på Matrigel är högre än tätheten av kolonierna av vanliga dela på MEFs. Placera plattan i ett 37 ° C vävnadskultur inkubator.
- För att upprätthålla hESCs på Matrigel är CM media kompletteras med 10ng/ml bFGF byts var 24 timmar i upp till 4-5 dagar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna video visar hur du passage hESCs från MEF plattor till feeder cellfria Matrigel plattor. Observera att kolonin densitet på Matrigel är högre än tätheten av kolonierna av vanliga dela på MEFs. Immunofluorescens färgning och mikroskopi eller flödescytometri för hESC pluripotens markörer, såsom oktober-4 och SSEA-4, behövs för att bekräfta underhåll av hESCs i en odifferentierad stat i feeder-fri kultur villkor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Mänskliga embryonala stamceller studier i Teitell labbet stöds av en California Institute för regenerativ medicin (CIRM) frö bevilja RS1-00.313. Vi tackar medlemmar i de allmänna Centrum för regenerativ medicin och stamcellsforskning vid UCLA, speciellt Dr Amander Clark, Dr Jerome Zack, och medlemmar av UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility för deras stöd för våra studier.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
