Summary
Dieses Video zeigt, wie das Wachstum von humanen embryonalen Stammzellen (hES) in Feeder-Zell-freien Bedingungen und wie kontinuierlich Durchgang hESCs in Feeder-Zell-freien Bedingungen aufrecht zu erhalten. Bestätigung der hESC Pluripotenz gewachsen in Feeder-Zell-freien Bedingungen durch Immunfluoreszenz-Mikroskopie ist auch bewiesen.
Abstract
Dieses Video zeigt, wie menschliche embryonale Stammzellen (hES) am embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF) Feeder-Zellen, wie die Passage hESCs von MEF Platten Feeder zellfreien Matrigel Platten zu wachsen.
Protocol
hESC Kultur tägliche Wartung
- hESC Kulturmedien müssen alle 24 Stunden gewechselt werden. Von der ES Medien Vorratsflasche bei 4 ° C gelagert, nehmen Sie die Menge der Lösung benötigt werden (~ 20ml pro 6-well-Platte), in einem 50ml Falcon-Röhrchen und warm bis 37 ° C in einem Wasserbad. Nachdem die Medien wird erwärmt, fügen bFGF Lagerung bei 4 ° C bis zu einer Endkonzentration von 10ng/ml. Legen Sie die bFGF Aktie wieder bei 4 ° C sofort nach Gebrauch!
- Entfernen Sie aus dem 6-Well-Platten alle, aber ~ 500μl der Medien. Vergewissern Sie sich, wirbeln die Kulturschale zu Schutt zu entfernen auszusetzen. Sicherstellen, dass die bFGF in der hESC Kulturmedien wird gründlich gemischt und fügen 3 ml frisches Medium zurück in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Legen Sie die Platte wieder in den Inkubator.
Splitting hESCs aus MEFs auf Matrigel
Normalerweise wird eine konfluente 6-Well-Platte von hESCs auf MEFs können von 1.02 Uhr bis 01.03 Uhr aufgeteilt werden auf Matrigel 6-well Platten mit den Vertiefungen zu konfluenten wieder 4-5 Tage nach der Trennung.
- Bei der Aufteilung hESCs auf Matrigel, MEF-konditionierte Medien (CM) wird verwendet, um zu halten Pluripotenz. MEF-konditionierten Medien erfolgt im Voraus. Am ersten Tag werden 1,5 × 10 7 γ-bestrahlten MEFs in eine T75 ausgesät. Am zweiten Tag sind MEFs einmal mit Raumtemperatur 1 × PBS, pH 7,4 gewaschen und anschließend 15 ml ES-Medien mit 5ng/ml bFGF ergänzt wird, um den Kolben gegeben. (HINWEIS: MEFs kann in kleineren oder größeren Kolben beschichtet werden, sondern Verhältnis zwischen Zelldichte und das Volumen der ES Medien sollten konstant sein.) Der Kolben bei 37 ° C wird für weitere 24 Stunden inkubiert. Am dritten Tag ist der CM gesammelt und mit 15 ml frischem ES-Medien mit 5ng/ml bFGF ergänzt ersetzt. Die gesammelten CM ist bei 4 ° C gelagert MEF-konditionierten Medien von einer Beschichtung von MEFs sind über sieben aufeinander folgenden Tagen geerntet bis 15 x 7 = 105ml generieren. Nach sieben Tagen sind alle CM Fraktionen vereinigt, sterilfiltriert, aliquotiert und bei -20 ° C. CM Media hergestellt, wie können gespeichert beschrieben und verwendet werden für 1 Monat.
- Einen Tag vor hESC Splitting, legte Matrigel Aliquots in Eppendorf-Röhrchen bei 4 ° C auftauen über Nacht (ein Aliquot enthält 76.2mg von Matrigel, und dies ist der Betrag für eine 6-Well-Platte erforderlich). Am Tag der Aufspaltung, nehmen Sie eine Flasche des aufgetauten Matrigel für eine 6-Well-Platte, legen Sie die Flasche und 6ml der kalten DMEM/F12 Medien auf Eis. Übertragen Sie die Matrigel in die DMEM/F12 Medien und gut mischen. 1ml der Lösung in jede Vertiefung einer 6-Well-Platte. Schwenken Sie die Platte auf Matrigel auf der Oberfläche verteilen und inkubieren Sie die Matrigel-bedeckten Platte bei Raumtemperatur für mindestens 1 Stunde vor der Spaltung der hESCs.
- hESCs auf MEFs werden einmal mit 1 × PBS, pH 7,4 gewaschen. Anschließend 1ml warmen Kollagenase IV (1mg/ml) in jede Vertiefung der 6-well-Platte gegeben und dann wird die Platte bei 37 ° C für 5-10 min.
- 1ml von ES Medien ohne bFGF in jede Vertiefung. Verwenden Sie eine 1ml Pipette auf die Stammzellen von der Platte zu blasen. Sammeln Sie alle Medien mit Klumpen von hES und tote MEFs in ein 50ml Falcon-Röhrchen. Lassen Sie große Klumpen von Zellen für 5-10 Minuten absetzen, so dass die hESC Klumpen ein Pellet Formular am Ende der Röhre, während die MEFs im Überstand suspendiert bleiben. Überstand verwerfen, und waschen durch Resuspendieren des hESC Pellet mit ES Medien fehlt bFGF, durch Zentrifugation bei Raumtemperatur bei 200g folgte für 5 min.
- Um Platte die Stammzellen auf Matrigel Platten ersten Waschen die Matrigel-Platten mit Raumtemperatur DMEM/F12 (1 ml pro well) und das Hinzufügen von 2,5 ml CM mit 10ng/ml bFGF pro Vertiefung ergänzt. Das Pellet in einem geeigneten Volumen von CM mit 10ng/ml bFGF, Pipette die Zellsuspension nach oben und unten mehrfach ergänzt, bis die Klumpen einheitlichen und klein geworden. Aliquot der Suspension bei 0,5 ml pro Vertiefung auf dem Matrigel Platte. Beachten Sie, dass die Kolonie Dichte auf Matrigel höher als die Dichte der Kolonien, die von üblichen Aufteilung auf MEFs ist. Die Platte wird in einem 37 ° C Gewebekultur-Inkubator.
- Zur Aufrechterhaltung der hESCs auf Matrigel ist CM-Medien mit 10ng/ml bFGF ergänzt alle 24 Stunden für bis zu 4-5 Tage gewechselt.
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Discussion
Dieses Video zeigt, wie die Passage hESCs von MEF Platten Feeder zellfreien Matrigel Platten. Beachten Sie, dass die Kolonie Dichte auf Matrigel höher als die Dichte der Kolonien, die von üblichen Aufteilung auf MEFs ist. Immunfluoreszenzfärbung und Mikroskopie oder Durchflusszytometrie für hESC Pluripotenz Marker, wie Oct-4 und SSEA-4, sind nötig, um Wartung von Zellkulturen in einem undifferenzierten Zustand in Feeder-freien Kulturbedingungen zu bestätigen.
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Acknowledgments
Menschliche embryonale Stammzellen-Studien in der Teitell Labor werden von einem California Institute for Regenerative Medicine (CIRM) Saatgut gewähren RS1-00313 unterstützt. Wir danken Mitglieder der Broad Center of Regenerative Medicine and Stem Cell Research an der UCLA, vor allem Dr. Amander Clark, Dr. Jerome Zack, und die Mitglieder des UCLA Broad Institute Stem Cell Core Facility für ihre Unterstützung unserer Studien.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
