Summary
וידאו זה מדגים כיצד לשמר את הצמיחה של בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) בתא ללא תנאים מזין וכיצד ברציפות hESCs מעבר במזין תא ללא תנאים. אישור hESC pluripotency גדל מזין תאים ללא תנאים על ידי מיקרוסקופ immunofluorescence באה לידי ביטוי גם. חלק 2 מתוך 3.
Abstract
וידאו זה מדגים כיצד לגדול בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) על פיברובלסטים עכבר עובריים (MEF) תאים מזין, איך hESCs קטע מתוך צלחות MEF לתא ללא מזין צלחות Matrigel.
Protocol
תרבות hESC יומי תחזוקה
- תרבות התקשורת hESC יש לשנות את כל 24 שעות. מתוך הבקבוק ES מניות המדיה המאוחסנים ב 4 ° C, להוציא את כמות הפתרון הדרוש (~ 20ml לכל צלחת 6-היטב), מקום בצינור בז 50 מ"ל, וחמים עד 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. ברגע התקשורת חיממה, להוסיף bFGF המאוחסן ב 4 ° C עד ריכוז סופי של 10ng/ml. שים את המניות בחזרה bFGF 4 ° C מיד לאחר השימוש!
- הסר מ 6 אבל גם צלחות כל ~ 500μl של התקשורת. הקפד מערבולת את המנה תרבות להשעות פסולת להסרה. ודא bFGF בתקשורת תרבות hESC מעורבב היטב להוסיף 3ml התקשורת טרי חזרה היטב בכל צלחת 6 באר. להחזיר את צלחת בחממה.
HESCs פיצול מן MEFs על Matrigel
בדרך כלל צלחת 6-ומחוברות היטב hESCs על MEFs ניתן לפצל 1:02-01:03 על Matrigel צלחות 6-היטב, עם בארות להפוך ומחוברות שוב 4-5 ימים לאחר פיצול.
- כאשר hESCs פיצול על Matrigel, MEF ממוזג התקשורת (CM) משמש כדי לשמור על pluripotency. MEF ממוזג התקשורת נעשית מראש. ביום הראשון, 1.5 × 10 7 γ-מוקרן MEFs הם זורעים לתוך בקבוק T75. ביום השני, MEFs נשטפים פעם עם בטמפרטורת החדר 1 × PBS, pH 7.4, ולאחר מכן 15 מ"ל של התקשורת ES בתוספת 5ng/ml bFGF מתווסף הבקבוק. (הערה: MEFs יכול להיות מצופה לתוך צלוחיות קטנות יותר או גדולות יותר, אך היחס בין צפיפות התאים והנפח של המדיה ES צריך להיות קבוע.) בקבוק הוא מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. ביום השלישי, CM נאסף מוחלף עם 15 מ"ל של התקשורת ES טריים בתוספת 5ng/ml bFGF. CM שנאסף מאוחסן 4 ° C. MEF ממוזג מדיה ציפוי אחד MEFs נקצרים על שבעה ימים רצופים כדי לייצר 15 × 7 = 105ml. לאחר שבעה ימים, שברים כל CM משולבים, מסונן סטרילי, aliquoted ומאוחסנים ב -20 ° C. התקשורת CM מוכן כמתואר ניתן לאחסן ולהשתמש בהם במשך חודש 1.
- יום אחד לפני פיצול hESC, לשים aliquots Matrigel צינורות Eppendorf ב 4 ° C להפשיר לילה (אחד aliquot מכיל 76.2mg של Matrigel, וזה הסכום הדרוש צלחת 6-גם אחד). ביום של פיצול, לקחת אחד בקבוקון של Matrigel מופשר לצלחת 6-טוב אחד, לשים את הבקבוקון ואת 6ml של DMEM/F12 התקשורת קר על הקרח. מעבירים את Matrigel לתוך DMEM/F12 התקשורת ומערבבים היטב. הוסף 1ml של התמיסה היטב בכל צלחת 6 באר. מערבולת הצלחת להפיץ Matrigel דגירה על פני השטח את הצלחת Matrigel מכוסה בטמפרטורת החדר למשך שעה לפחות לפני 1 פיצול hESCs.
- hESCs על MEFs נשטפים פעם עם 1 × PBS, pH 7.4. בהמשך 1ml של חם collagenase IV (1mg/ml) מתווסף גם כל צלחת 6-היטב ולאחר מכן את הצלחת הוא מודגרות על 37 מעלות צלזיוס למשך 5-10 דקות.
- הוסף 1ml של התקשורת ES ללא bFGF היטב כל אחד. השתמש פיפטה 1ml לתקוע בתאי גזע מהצלחת. לאסוף את כל התקשורת המכיל גושי hESCs והמתים MEFs לתוך צינור בז 50 מ"ל. בואו גושים גדולים של תאים להסתפק 50-10 דקות, כך גושים hESC צורה כדורית בתחתית של התחתית בעוד MEFs נשארים תלויים supernatant. בטל supernatant, ולשטוף ידי resuspending hESC גלולה באמצעות מדיה ES חסר bFGF, ואחריו צנטריפוגה בטמפרטורת החדר 200 גרם ב 5 דקות.
- כדי בצלחת בתאי גזע על צלחות Matrigel, תחילה לשטוף את הצלחות Matrigel עם בטמפרטורת החדר DMEM/F12 (1ml לכל היטב) והוספת 2.5ml של CM בתוספת 10ng/ml bFGF לכל טוב. Resuspend גלולה בהיקף מתאים של CM בתוספת 10ng/ml bFGF, פיפטה ההשעיה התא למעלה ולמטה מספר פעמים, עד גושים הופכים אחיד קטן בגודל. Aliquot את ההשעיה על 0.5ml לכל היטב על הצלחת Matrigel. שים לב כי צפיפות המושבה על Matrigel הוא גבוה יותר מאשר צפיפות מושבות ידי פיצול כרגיל על MEFs. מניחים את צלחת 37 ° C רקמות התרבות בחממה.
- כדי לשמור על hESCs על Matrigel, התקשורת CM בתוספת 10ng/ml bFGF משתנה כל 24 שעות למשך 4-5 ימים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
סרט הווידאו הזה מדגים כיצד hESCs קטע מתוך צלחות MEF לתא ללא צלחות מזין Matrigel. שים לב כי צפיפות המושבה על Matrigel הוא גבוה יותר מאשר צפיפות מושבות ידי פיצול כרגיל על MEFs. מכתים immunofluorescence ו cytometry מיקרוסקופית או זרימה עבור סמנים hESC pluripotency, כגון אוקטובר-4 ו SSEA-4, יש צורך לאשר אחזקת hESCs במצב מובחן במזין ללא תנאים התרבות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
האדם מחקרים בתאי גזע עובריים במעבדה Teitell נתמכים על ידי המכון לרפואה בקליפורניה הרגנרציה (CIRM) זרע מענק RS1-00313. אנו מודים לחברי המרכז רחבה של רפואה רגנרטיבית ואת המחקר בתאי גזע ב-UCLA, במיוחד ד"ר Amander קלארק, ד"ר ג'רום זק, וחברי רחבה UCLA מכון מתקן נייד Core גזע על תמיכתם של מחקרים שלנו.
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Knockout Serum Replacer (KSR) | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 10828-028 | |
| DMEM/F12 | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11330-057 | |
| Non-essential Amino Acids | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMax | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 35050-061 | |
| DMEM | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 11995-065 | |
| FBS | Reagent | Clontech Laboratories | 631107 | |
| L-glutamine | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 25030-081 | |
| BME | Reagent | Fisher Scientific | BP176-100 | |
| bFGF | Reagent | R&D Systems | 233-FB-025 | |
| Collagenase IV | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 17104-019 | |
| Dispase | Reagent | Stem Cell Technologies | 17105-041 | |
| Penicillin / Streptomycin | Reagent | GIBCO, by Life Technologies | 15140-122 | |
| Gelatin | Reagent | Chemicon International | ES-006-B | |
| Matrigel | Reagent | BD Biosciences | 354277 | |
| Oct-4 antibody | Reagent | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | SC-9081 | |
| anti-h/mSSEA-4 Phyc–rythrin Conjugated Mouse IgG3 | Reagent | R&D Systems | FAB1435P | |
| FITCI-conjugated antirabbit IgG | Reagent | Jackson ImmunoResearch | 715-095-152 |
References
- Thomson, J. amesA., Itskovitz-Eldor, J. oseph, Shapiro, S. anderS., Waknitz, M. ichelleA., Swiergiel, J. enniferJ., Marshall, V. ivienneS., Jones, J. effreyM. Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts . Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Xu, C. hunhui, Inokuma, M. argaretS., Denham, J. errod, Golds, K. athaleen, Kundu, P. ratima, Gold, J. osephD., Carpenter, M. elissaK. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19, 971-974 (2001).
